196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
4 196462 5 A találmányunk szerinti eljárásnál anti-proteolitikus ágensként bármely guanidinium-sót felhasználhatunk. Guanidinium-sóként szerves savakkal (pl. ecetsavval) vagy ásványi savakkal (pl. hidrogén-halógenidekkel, mint pl. sósavval, hidrogén-bromid dal, hidrogén-fluoriddal és hidrogén-jodiddal) képezett sókat egyaránt felhasználhatunk. Guanidinium-sóként előnyösen guanidin-hidrokloridot alkalmazhatunk. A guanidinium-só koncentrációja a mikroorganizmus kezelésnél nem döntő jelentőségű tényező és bármely hatásos koncentráció érték lehet. A mikroorganizmust előnyösen a guanidinium-só 3-7 mól/liter koncentrációjú oldatával kezelhetjük, és 1 g transzformált mikroorganizmusra vonatkoztatva kb. 3-9 térfogat rész só-oldatot alkalmazhatunk. A só-koncentrációt oly módon állíthatjuk be, hogy a só megfelelő mennyiségét alkalmas oldószerben felvesszük. Oldószerként pl. vizet vagy vizes puffereket (pl. ammónium-acetátot vagy piridin/ecetsav elegyet stb.) alkalmazhatunk. A szakember száméra előrelátható, hogy a találmányunk szerinti eljárásnál más proteáz inhibitor reagensek is felhasználhatók (pl. karbamid vagy tiocianét). A tisztított rlFN-'í-t végül oly módon nyerjük, hogy az E. Coli felülúszót extrakció és megfelelő hígítás után közvetlenül tisztítjuk - előnyösen monoklonólis anti-test tisztitásos lépés segítségével. Az extrakció és a tisztítási eljárás a nagyléptékben történő termelés céljainak megfelelően automatizálható. Találmányunk segítségével ily módon első Ízben nyílik lehetőség nagymennyiségű homogén rIFN-í előállítására és ezáltal kiterjedt klinikai vizsgálatok, biológiai kísérletek, röntgen-krisztalogréfiai és szerkezet-funkció tanulmányok elvégzésére. A találmányunk szerinti eljárással előállított intakt rekombináns humán immun interferon képlete a következő: Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Alá Gly His Ser Asp Val Alá Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys He Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser He Gin Lys Ser Val Glu Thr He Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu He Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Alá Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin. Eljárásunk további részleteit a leírás alábbi részében és a példákban ismertetjük. Az E. Coli által termelt rekombináns humán immun interferont előnyösen fagyasztott sejt-pépből 7 mól/liter koncentrációjú guanidín-hidrokloriddai extraháljuk és megfelelő tisztítási eljárásokkal tisztítjuk (pl. monokionális anti-test affinitás oszlopon). A kb. 18000 dalton (18K) látszólagos molekulatőmegű tisztított interferont (SDS-PAGE alapján) guanidines extrakcióval nyerjük, míg az alacsony molekulatömegű speciest (a fő-species molekulatömege kb. 15000 dalton, 15K) guanidin távollétében történő szonifikációval izoláljuk. Mind a 18K mind a 15K fehérjék amino-terminális szekvenciája összhangban áll a humán immun interferon fehérje DNS szekvencia kódolása alapján várható szekvenciával. A C terminális frekvenciát oly módon határozzuk meg, hogy a tisztított C-terminális pepiidet CNBr kezelés után analizáljuk és szekvenciáját meghatározzuk. A 18K rlFN-^ból felszabadított C-terminális peptid aminosav-összetétele és szekvenciája a rlFN-'ü előrelátható szekvenciájának felel meg, ami azt jelenti, hogy a 18K species az intakt molekula. Másrészről CNBr kezelés hatáséra a 15K rlFN-? C-végcsoportjából különböző peptid-fragmensek szabadulnak fel. Aminosav- és szekvencia-analízis alapján e különböző peptidek a 121-131 sz. aminosav-maradékoknak felelnek meg, ami azt mutatja, hogy a 15K species a proteolitikus termék. A találmányunk szerinti eljárás előnyös foganatositási módja szerint a fermentációs műveletnél recipiensként az Escherichia coli K-12 294 törzset alkalmazzuk, feltéve, hogy mást nem közlünk. Ezt a törzset a 2 055 382A sz. brit szabadalmi bejelentésben írták le és az American Type Culture Collection intézménynél 1978. október 28-án ATCC 31 446 számon deponálták. Minden rekombináns DNS műveletet a National Institutes of Healt irányelveinek megfelelően végeztünk el. Találmányunkat azonban nem korlátozzuk a fent említett E. coli K-12 294 törzs alkalmazására, hanem eljárásunk során más ismert E. coli törzsek (pl. E. coli MA210 vagy E. coli RR1 /ATCC 31 343/) vagy más mikroorganizmusok is felhasználhatók, amelyek sok képviselője bárki száméra hozzáférhető vagy deponálásra került és elismert mikroorganizmus letétbehelyező intézmények útján beszerezhető (pl. American Type Culture Collection, lásd ATCC katalógus). A rIFN-"ji C-végcsoportjának utolsó 16 aminosav-inaradékából (azaz 131-146 sz. aminosavak maradékából) álló szintetikus polipeptid monoklonólis anti-testjeit állítjuk elő. A rlFN-K tisztítására az egyik monoklonélis anti-testet alkalmazzuk (Mo k 2-11.1). A találmány során a monoklonélis anti-testeket és az anti-test affinitásös oszlopot a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban foglaltak szerint készítjük el. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük. 1. példa Antigénként használt hordozófehéi-je-poli peptid komplex szintézise 5 lí) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
