196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
18 196-161 19 11. példa Az rlFN-y termeléshez E. coli RR1 törzset alkalmazunk (pRK148cIts, pRC231/IFl-900) (e rekombináns organizmus szerkezetét a 99 084 sz. európai szabadalmi leírásban ismertették). A pRK248clts és pRC231/IFl-900 plazmidok hőmérsékletre érzékeny Lambda-represszort és IFN-y géneket tartalmaznak. Az rIFN-ü gének kifejezésre juttatása a Pl promoterrel való szabályozás alatt történik. Az E. coli RR1 törzs (pRK248cIts, pRC231/IFI-900) egy éjszakás tenyészetét LB táptalajon 30 °C-on tenyésztjük. Az egy éjszakás tenyészet 1 literét kazamino-savakat tartalmazó minimális M-9 táptalajjal 10 literre hígítjuk. A .kazaminosavak' a kazein hidrolízisével előállított, mikrobiológiában használatos aminosav-keverékek. A .minimális M-9 táptalaj" összetétele: dinátrium-hidrogén-foszfát 6 g/1; kálium-dihidrogén-foszfát 3 g/1; nátrium-klorid 0,5 g/1; ammónium-klorid 1 g/1; 1 mól/liter koncentrációjú magnézium-szulfát 2 ml/1; 1 mól/liter koncentrációjú kalcium-klorid 0,1 ml; 20%-os glükóz 10 ml/1; pH = 7,4. Logaritmikus növekedés mellett a tenyészet hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °C-ra növeljük, majd a tenyésztést 42 °C-on 2-3 órán át folytatjuk. A baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük és a baktérium-tartalmú labdacsokat felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A fermentáció és a feldolgozás minden műveletét a National Institutes of Health rekombináns DNS irányelveivel összhangban végezzük el. Az rlFN-'ü szintetikus 131-14G. C-terminális peptidjeinek monoklonális antitestjeit a fenti módszerrel készítjük el. Az rlFN-v tisztítására Mou2-ll.l monoklonális antitestet alkalmazunk. A monoklonális antitest-oszlopot a 10. példában leírtak szerint készítjük el. A rlFN-'V 14C-jód-ecetsavval történő karboximetilezést 6 mól guanidin-hidroklorid jelenlétében, a (3) irodalmi helyen leírtak szerint hajtjuk végre. A reagens fölöslegét C-8 fordított fázisú oszlopon történő nagynyomású folyadékkromatogi-afálással távolítjuk el. A karboxipeptizédos bontást 0,2 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oidatban a (4) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A rIFN--ji CNBr-el történő kezelését Imetioninhoz viszonyítva 100-szoros moláris fölösleg) 70%-os hangyasavban az (5) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A CNBr peptideket C-18 fordított fázisú oszlopon nagynyomású folyadék kromatografálással választjuk el. A peptid eluálását 0 és 70% közötti mennyiségű metil-cianidot tartalmazó trifluor-ecetsav elegyekkel lineáris gradiens szerint végezzük el. A fehérje vagy peptid mintákat lezárt, nitrogénnel öblített, evakuált csövekben, 4% tioglikolsavat tartalmazó állandó forrásban levő sósavban 20-24 órán át hidrolizáljuk. Az aminosav-analizist a (6) irodalmi helyen leírtak szerint fluoreszcamin aminosav-analizátorban hajtjuk végre. A karboximetilezett fehérjék szekvencia analíziséhez a (7) irodalmi helyen leírtak szerint ABI (Applied Biosystem Inc.) gázfázisú szekvenciátort (470A) alkalmazunk. A PTH-aminosavak mintáit a (81 irodalmi helyen leírtak szerint ultraszferikus ODS oszlopon fordított-fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával azonosítjuk. Valamennyi tisztítási lépést 4 °C-os hőmérsékleten végezzük el. 25 g fagyasztott sejtet háromszoros mennyiségű (75 ml) 7 mól/liter koncentrációjú guanidin-hidrokloridban szuszpendálunk (pH = 7). Az elegyet 1 órán át keverjük, majd 1 órán keresztül 30 000 g sebességgel centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékot tízszeres mennyiségű, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal (PBS) vagy 0,15 mólos nátrium-bo?'át-pufferrel (pH = 9,5) hígítjuk, majd 30 percen keresztül 30 000 g sebességgel centrifugáljuk. Eljárhatunk oly módon is, hogy 25 g fagyasztott sejtet másfélszeres térfogatú 137,5 ml) 0,15 mólos nátrium-borát—pufferten (pH = 9,5) szuszpendálunk és 1 órán át keverünk. Az elegyet 30-30 mp-ig 5 ízben szonifikáljuk, majd 30 000 g sebességgel 1 órán át centrifugáljuk. A guanidin-hidrokloridos extrakcióból vagy szonifikációból származó, felül elhelyezkedő folyadékokat forgó rázató gépen 25 ml kovasavval 1 órán ét keverjük, majd PBS-el előmossuk. Az elegyet oszlopra visszük fel és az oszlopot összesen 20-30 oszioptérfogatnyi 1 mólos nátrium-klorid-oldatta) mossuk. Az oszlopot 0,5 mól tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 8) elualjuk. Az interferont kb. 200 ml oldószerrel eluáljuk és 4 részre osztjuk. Minden részletet PBS-el egyensúlyba hozott monoklonális antitest ("g 2—11.1) affinitás oszlopra viszünk fel (4 ml agytérfogat). Az oszlopot 10 oszloplérfogatny’i PBS-pufferrel mossuk, majd 1 mólos guanidin-hidrokloriddal vagy 50%-os etilénglikollal [amely 1 mól nátrium-kloridot és 20 mmól nátrium-foszfát puffert (pH c 7,0) tartalmaz] eluáljuk. Az interferont az első 20 ml-el eluáljuk. Az SDS-PAGE elvégzése Laemmli módszerével történik (9. irodalmi hely’). A fehérjét fluoreszcamin analízissel határozzuk meg, referens standardként kristály’os marha-széruni-albumint alkalmazunk. Az interfei'on aktivitást a 10. irodalmi helyen leirt módon, vesicularis stomatitis virus és humán WISH sejtek felhasználásával, a citopatikus hatás inh biciós assay’ segítségével határozzuk meg. Az összes interferon titert a részlegesen tisztított humán immun interferon referencia standardhoz viszonyítva, referens egység/ml formájában fejezzük ki. Az extrakciós tisztítási műveleteket a 6. táblázatban foglaljuk össze. Az össz-kitermelés 25-32% és a tisztítás mértéke 100-769-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
