196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
20 196461 21-szoros, az átlagos fajlagos aktivitás lxlO7 egység/mg. Az rIFN--)( össz-kitermelése a guanidines extrakció esetében 3-4-szer nagyobb. A tisztítási műveletek utolsó lépésének SDS-PAGE diagrammját az 1. ábrán mutatjuk be. A guanidines extrakcióval tisztított termék kb. 18 000 daltonnái (18K rlFN-^l egyetlen sávot mutat, mig a szonifikációs eljárás esetében kb. 15 000 daltonnal (15K rlFN-u) egy fősáv és kb. 17 000 daltonnái (l.A ábra) egy melléksáv jelentkezik. Nem-redukáló gélen a rlFN-y dimerjci és oligomer jei is képződnek (1B ábra). A 18K rIFN-y homogén, és aminosav-összetétele a DNS szekvencia alapján várható összetételnek felel meg. A 15K és 18K rlFN-^ aminosav-összetételét a 7. táblázatban tüntetjük fel. Automata gázfázisú fehérje/peptid szekvencia meghatározó készülékben néhány száz pikomól redukált és karboximetilezett 15K és 18K fehérje Edman-bomlást szenved, A 15K illetve 18K fehérjék első 32 és 26 maradékénak aminosav-N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártnak felelnek meg (2. ábra). A szekvencia analízis első és harmadik ciklusában 1JC-karboximetilezett ciszteineket mutattunk ki. N-terminális metionint nem mutattunk ki. A 18K és 15K rlFN-'x N-terminális szekvencia analízise azt mutatja, hogy mindként fehérje esetében e tartományok szekvenciája a DNS szekvencia alapján várttal azonos. A fenti tartományban fellépő esetleges kiesések vagy változások meghatározása céljából a C'-terminális peptideket is jellemezzük. A karboxipeptidáz A (CPA) által megbontott elegy aminosav analízise azt mutatja, hogy a 18K rlFN-y-ból szerin és/vagy glutamin (C-terminális aminosavak) szabadul!nak) fel, ugyanakkor azonban azonos körülmények között a CPA a 15K rlEN-tj-t nem bontja. Minthogy a Ser-Gin képezi a rlFN-tj C-terminális szekvenciáját, a 18K species intakt C-terminust tartalmaz, míg a 15K species esetében a C-terminális maradék (Lys) ettől eltérő és CPA nem bontja. A DNS-szekvencia alapján várható C-terminális maradékok további bizonyítása céljából a C-terminális peptideket CNBr-es kezelés után analízisnek és szekvencia-meghatározásnak vetjük alá. A C-terminális peptideket C18 fordított-fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét (3. ábra). A 15K rlPN-í esetében a gradiens korai részéből eluálva erős peptid csúcsot (II. csúcs) nyerünk és ez a peptid a 18K rlFN-í CNBr-el történő megbontása után kapott keverékben nincs jelen. A fenti peptid aminosav-analizis alapján homoszerint vagy homoszerin-laklont nem tartalmaz és ezért a 15K fehérje C-terminális CNBr peptidjének tekintendő. A fenti fehérje aminosav-analizis alapján (8. táblázat) az IFN-y 121-131 sz. aminosav-maradékának felel meg (arginin nem mutatható ki). A 11 aminosav szekvenciáját szekvencia-analízissel igazoljuk (2. ábra). A 18K rlFN-y esetében az eluálás korai részében viszonylag széles csúcsot kapunk, amelyet sekély gradienssel két csúcsra választunk szét. Az aminosav' analízis azt mutatja, hogy az első csúcs a 18K fehérje CNBr C-terminális peptidje (8. táblázat) és az aminosav-összetétel a 138-146. aminosav-maradéknak felel meg. A 9 aminosav szekvenciáját szekvencia-meghatározással igazoljuk (2. ábra). A 15K fehérje C-terminális aminosava a meghatározás alapján lizin. A fenti eredmények igazolják, hogy a 18K species az érintetlen rIFN-K molekula, mig a 15K species a proteolitikus termék. A 131 sz. aminosav és a 132 sz. aminosav maradékai közötti peptid kötést (Lys-Arg) a 15K speciesen hasítja el. 12. példa 18K rlF'N-ji triptikus peptid térképe A 18K rlFN-’tf triptikus peptid feltérképezését végezzük el. 18K rlFN-)i-t (43 ug) TPCK-tripszinnei (1,1 ug, Worthington, USA) 37 °C-on 18 órán át 147 ul 25 mmólos ammórtium-acetát/nátrium-hidroxid-oldatban {pH = 8.0) kezelünk. A feltárt oldathoz 2- -inerkapto-etunolt (0,6 ul) adunk és az inkubálást 2 órán át folytatjuk. A reakciót 53 ul 1%-os t rifluor-ecetsav 1TFA) hozzáadásával leállítjuk. A teljes elegyet Ultrasphere-oktil oszlopon (5 um, 4,6x250 nm, Altex, USA) kromatografáljuk; az oszlopot előzetesen 0,02% TFA-5% CHoCN eleggyel egyensúlyba hozzuk. Az eiuálást 30 °C-on 5-70% CH3CN lineáris gradiens szerint 1,0 ml/perc sebességgel végezzük el. Az át.csepegö folyadékot fluoreszcamin felhasználásával fluorometrikus módszerrel ellenőrizzük. A kapott térképet a 4. ábrán tüntetjük fel. 13. példa 18K rIFN-y' C-terminális aminosavának meghatározása A 18K rIFN-Tj C-terminális aminosavát hidrazinolizissel Narita és tsai módszerével határozzuk meg [J. Biochem. (Tokyo) 59, 170 (1966)1. 18K rlFN-^-t (185 ug) vízmentes feidrazinnal G órán át 100 °C-on hevítünk. A liofilizált hidrazinolizátumot vízben oldjuk és benzaldehidet adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán át erőteljesen rázzuk, majd centrifugáljuk. A felulúszót liofilizáljuk és aminosav- összetételét meghatározzuk; aminosavat nem mutattunk ki. Ez az eredmény megfelel annak a ténynek, hogy a 18K species C-terminális aminosava a glutamin. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
