196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
6 196460 i gyógyászati készítményekhez további adalékokat {pl. ízesítő anyagokat, tartósítószereket, stabilizálószereket, emulgeálószereket, puffereket stb.) is adhatunk, a gyógyszergyártás ismert módszerei szerint. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények az alábbi szokásos típusokba tartozhatnak: a) Orális adagolásra alkalmas szilárd készítmények (pl. tabletták, kapszulák, drazsék, porok, granulák stb.). b) Orális adagolásra szolgáló folyékony készítmények (pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixirek stb.). c) Parenterális adagolásra szolgáló készítmények (pl. steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók stb.). d) Helyi alkalmazásra szolgáló készítmények (pl. oldatok vagy szuszpenziók, kenőcsők, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszol stb.). A gyógyászati készítmények sterilezhetók és/vagy adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket, az ozmózis nyomás változásához előidéző sókat és/vagy puffereket) tartalmazhatnak. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziós vagy injekciós oldatok lehetnek. Ezek a készítmények is további, a találmányunk szerint előállított új immun interferonnal szinergetikus kölcsönhatásba nem lépő gyógyászati hatóanyagokat tartalmazhatnak. A parenterális készítményekhez a gyógyszergyártás ismert módszerei szerint további adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló- vagy emulgeálószereket, puffereket stb.) is adhatunk. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. /. példa Antigénként használt hordozóíehérje-polipeptid komplex szintézise A H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu- Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH polipeptidet thyro-globulinnal (a továbbiakban TG) kapcsoljuk Goodfriend és társai módszerével [Science 144, 1334 (1964)]. Magát a peptidet szokásos peptid-szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő. A szilárdfázisú és folyadékfázisú módszert egyaránt felhasználhatjuk, bár sok esetben a folyékony fázisú szintetikus módszer előnyös. Megfelelő peptid-szintéziseket pl. az alábbi irodalmi helyek írtak le: Schröder és Lübke: .The Peptides', Vol. 1. Academic Press, New York, USA, 1966; vagy Izumiya és társai: .Peptide Syntheses", Maruzen, Tokyo, Japán, 1975; vagy Haruaki Yajima: .Experiments in Biochemistry", Vol. 1. 207-400 oldalak, Tokyo Kngaku Dojin, 1977. E módszerek közül - többek között - az azidos, kloridos, savanhidrides, vegyes savanhidrides, DCC és aktív észteres módszereket, a Woodward K.-reagenst, felhasználó módszert, a karbodiimidazolos módszert, az oxidációs-redukciós módszert és a DCC/addiciós (pl. HONB, HOBt, HOSu) módszert említjük meg. Az IFN-v 131-146. fragmensének részletes előállítása a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban került ismertetésre. 2,5 mg fenti polipepl.idet 3,75 mg TG-vel összekeverünk, majd 2 ml 50 millimólos foszfát-puffért adunk hozzá és az elegyet jegesvízben erőteljesen keverjük. Ezután fokozatosan 30,4 mg karbodiiniid-hidroklorid és 200 ml desztillált viz oldatát csepegtetjük hozzá. A reakció befejeződése után desztillált vízzel szemben 24 órán át dializéljuk, majd liofilizáljuk. 4,7 mg fehérje-komplexet kapunk. 2. példa Enzimhez kötött antigén előállítása az enzim immunológiai meghatározásához (EIA) az antitest kimutatásához Az EIA számára az enzimhez kötött antigént Kitagawa és társai módszerével állítjuk elő [Journal of Biochemistry 79, 233 (1976)1. (i) A maleimido-csoport bevitele a polipeptidbe Az 1. példa szerint előállított polipeptidet (350 nmól) 1 ml 100 nmólos foszfát-pufferben oldjuk (pH 6,8) és az oldatot 585 Mg (1,75 Mmól) N-(4-karboxi-ciklohexil-metil)-maleimid N-hidroxi-szukcinimid-észternek 70 pl N,N-dimeLil-formamiddal képezett oldatához adjuk. Az elegyet 30 °C-on 30 percen át keverjük. A reakció befejeződése után Sephadex G-25 oszlop felhasználásával kromatografálva 185 nmól, bevitt maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid frakciót kapunk. (ii) A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid fl-D-galaktozidázzal történő kapcsolása A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptidet (16,5 nmól) 3,3 nmól ß-D-galaktozidázzal elegyítjük. A reakciót 4 °C-on 18 órán át végezzük, majd 412,5 nmól /3-merkapto-etanol hozzáadásával leállítjuk. A fl-D-galaktozidázzal kapcsolt polipeptidet Sepharose 6B oszlopon frakcionáljuk és a további kísérletekben felhasználjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 15 50 55 60 5
