196460. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén immun interferon fragmens és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

8

196460

9

3. példa Immunizálás

6 db 7-8 hetes BALB/C egeret 40 pg (fehérjében kifejezve) az 1. példa szerint előállított fehérje-komplex mint antigén Freund-féle teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután inokulálunk (primer immunizálás). A primer immunizálás után két héttel az egereket a fentivel azonos dózisú antigén Freund-féle nem-teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután ismét inokuláljuk (szekunder immunizálás). További két hét elteltével a második immunizálással azonos módon harmadik immunizálást hajtunk végre. A harmadik immunizálás után G nappal az egerekből részle- 5 ges vérmintát veszünk és a szérum-antitest titereket az alábbiakban ismertetésre kerülő EIA-módszerrel meghatározzuk [lásd: Immunopharmacology 1, 3 (1978)]. A legmagasabb antitest-titert mutató n~2 számú egeret 10 120 jug antigén 0,5 ml vizes nátrium-kloriddal

képezett oldatának intravénás inokulálásával végző immunizálásnak vetjük alá. Az egyes egerek antitest-titer adatait az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Immunizált egerek antipeptid-antitest titere

B/T (%)

Az egér száma

Első immunizálás 1/

Második immunizálás 2/

Harmadik immunizálás 3/

í-i

4/

N.D.

24.5

2

N.D. 5/

19.3

35.3

3-N.D.

24.7

4

N.D.

1.3

1.7

5

N.D.

1.8

5.0

6

normál

N.D.

0.8

egér

0.6

0.1

N.D.

1/ Szérum higitás aránya: 1/1000 2/ Szérum hígítás aránya: 1/6300 3/ Szérum hígítás aránya: 1:7800 4/ -: nem kimutatható 5/ N.D.: nem határoztuk meg

B/T: [kötött enzim aktivitás/ teljes hozzáadott enzim aktivitás) x 100

EIA-módszer

A 2. példa szerint előállított fehérjekomplex-szel immunizált egerek szérumában vagy a hibridoma felülúszóban levő antitest-aktivitást EIA-módszerrel határozzuk meg [Immunology 1, 3 (1978)]. A szérumot vagy a hibridoma felülúszót A-pufferrel (20 mM NazHPCM, 100 mM NaCl, 0,1% NaN3, 1 mM MgClz, pH 7,0) hígítjuk, majd a hígított elegy 100 pl-es részletét 100 pl enzimhez kötött polipeptid-származékkal (2. példa) elegyítjük és a reakciót 24 °C-on 24 órán ót folytatjuk. Ezután 100 aiI 3%-os, nyúl anti-egór IgG-vel kapcsolt cellulózt adunk hozzá és a x reakciót 24 °C-on 4 órán ót folytatjuk. A reakció befejeződése után a cellulózt 0,5% Tween 20-t tartalmazó A-pufferrel alaposan mossuk, majd 500 pl 20 pg/ml-es 4-tnelil-unibelliferil-ß-D-galaktozidot adunk hozzá. A reakciót 37 °C-on 2 órán át végezzük, majd 3 ml 100 nmólos karbonát-puffer (pH 10,5) hozzáadásával leállítjuk. A fluoresszencia intenzitást fluorométerrel mérjük (gerjesztés 365 nm; emisszió 450 nm).

4. példa

Sejt-fúziá

45

A 3. példában leírt végső immunizálás után három nappal a ?-2 egér lépét kivágjuk, rozsdamentes szűrőn nyomás alatt átszűrjük és Eagle-féle minimális esszenciális 50 közegben (MÉM) szuszpendáljuk. Ily módon lép-sejt szuszpenziót nyerünk. A sejt-fúzióhoz BALB/C egérből származó P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) mieloma-sejteket alkalmazunk [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 55 (1978)]. A sejt-fúziót Köhler és Milslein eredeti módszerével végezzük el [Nature 256, 495-497 (1975)]. A lépsejteket és P3U1 sejteket külön-külön szérum-mentes MEM-el háromszor mossuk és 5:1 arányban (a sejtek 60 számában kifejezve) összekeverjük. Az elegyet 800 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, ezalatt a sejtek kiülepednek. A felül elhelyezkedő folyadék alapos eltávolítása után az üledéket enyhén fel- 65 lazítjuk, 0,3 ml 45%-os polietilénglikol (PEG)

6