196459. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neomycin előállítására
4 196459 5 hogy az NR-8/51 jelű törzsre jellemző maximális neomicin termelőképességet csak 100% oldott oxigénszint mellett lehet elérni. (A mindenkori oxigénszint az induló fermentáció telítési oxigénszintjére (100%) vonatkoztatott, ennek %-ában kifejezett érték, amely a fermentlébe helyezett oxigénméró elektróddal vagy tömegspektrométer szondával - műszeresen mérhető). Laboratóriumi körülmények között a 100% oldott oxigénszintet 35 ml táptalaj alkalmazása mellett biztosítani tudtuk. Nagyüzemi léptékű gyártás esetén azonban különböző okok miatt (a fermentorkészülék alakja, a keverő típusa, a felhasznált energia korlátozott volta, a levegőellátó rendszer szűk kapacitása, habzás stb.) a 100% oldott oxigénszint legtöbbször nem valósítható meg. Kísérleteink során azt is megállapítottuk, hogy az NR-8/51 jelű törzs maximális termelőképességének megfelelő hatóanyagkoncentrációt 100%-nól alacsonyabb oxigénszint esetén nem lehet elérni. Tapasztalataink szerint azonban a 100%-nál alacsonyabb oxigénszintek esetében is biztosítható a táptalajkoncentráció megfelelő módon történő megválasztásával egy, az adott oxigénszint által megszabott maximális hatóanyagkoncentráció. Ez a koncentrációérték természetszerűleg alacsonyabb, mint amit a törzs ideális körülmények között képes megtermelni, mégpedig annál alacsonyabb, minél kisebb az oldott oxigénszint értéke. Ezért a technológiai körülmények által meghatározott mindenkori oldott oxigénszinthez el kell végezni a táptalaj optimalizálást. További felismerésünk szerint a táptalajoptimalizálásnál jól hasznosítható a fermentlé alkalikus proteáz aktivitásának és ammónia nitrogénszintjének nyomon követése a fermentáció során. Az alkalikus proteáz aktivitás változása az optimális mennyiségű nitrogénforrás, az ammónia nitrogénszint alakulása az optimális mennyiségű szénforrás meghatározásához nyújt segítséget. 5 Kísérleteink szerint a táptalaj nitrogénforrás koncentrációja (szójaliszt koncentráció) akkor megfelelő, ha az alkalikus proteáz aktivitás a fermentáció 50-60. órájától kezdve fokozatosan, 2-3 mAE/ml-tól 15-35 mAE/ml-ig 10 emelkedik a fermentáció befejeztéig. Ha ez az emelkedés elmarad, csökkenteni kell a fehérje-nitrogénforrás mennyiségét, ha a növekedés túl gyors (pl. már a fermentáció közepére eléri a megadott tartományt), akkor nö- 15 vélni kell. Tapasztalataink szerint az ammónia nitrogénszint alakulása akkor a legkedvezőbb a törzs hatóanyagtermelése szempontjából, ha a fermentáció első 20 órájában kialakuló 20- 20 -30 mg/100 ml szint fölé nem emelkedik, majd egy gyors (8-10 óra alatt bekövetkező) csökkenés után 10 mg/100 ml szint alatt marad. Az ammónia nitrogénszintet a táptalaj monovagy oligoszaharid koncentrációjának változ- 25 tatásával, célszerűen glükózzal lehet befolyásolni. Ha az ammónia nitrogénszint a fent megadott érték fölé emelkedik, a glükóz mennyiségét növelni kell, ha viszont alatta marad, a glükóz mennyiségét csökkenteni 30 kell. A glükóz mennyisége egyben meghatározza a felhasznált keményítő mennyiségét is, ami a mindenkori glükóz koncentrációnak a 3-6 szorosa. 35 Az általunk kidolgozott optimalizálási módszer szerint a különböző oxigénszinteknek megfelelő táptalaj összetételeket a 2. táblázatban adjuk meg. 2. táblázat Főfermentációs táptalajok összetétele Táptalajkomponensek Oldott oxigénszint 2-10% (NF-12) 60-70% (NF-6) 100% (NF-8) szójaliszt 3.8% 5.0% 6.0% kukorica-finomliszt (keményítő tart.: 80%) 7.0% 7.0% 7.5% glükóz 1.5% 1.7% 2.0% kalcium- kar bonát 0.25% 0.25% 0.25% nátrium-klorid 0.5% 0.5% 0.5% növényi olaj (szója, pálma, napraforgó) 0.1% 0.1% 0.1% A két szélső érték közötti oldott oxigénszintekhez tartozó optimális táptalajösszetételt a megadott optimalizálási módszerrel a konkrét helyzetnek megfelelően ki lehet alakítani. A különböző oldott oxigénszinteknek megfelelően optimalizált összetételű táptalajok alkalmazása esetén elérhető neomycin fermentációs szinteket a 3. táblázatban tüntettük 65 fel. 4
