196459. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neomycin előállítására
2 196459 3 Találmányunk tárgya eljárás neomícin előállítására Streptomyces fradiae törzs süllyesztett fermentációjával, 0,2-0,5% össznitrogénnek megfelelő nitrogénforrást és 6,0-10,0% keményítőtartalomnak megfelelő szénforróst tartalmazó táptalajon, amelyben levegőztetéssel a telítési értékre számított 2-100% oldott oxigénszintet biztosítunk és a fermentációt 30-36 °C-on, előnyösen 32-34 °C-on, 120-160 óráig folytatjuk, majd a fermentléből a neomicint ismert módon kinyerjük oly módon, hogy a fermentációhoz MNG-00313 szám alatt deponált Streptomyces fradiae NR-8/51 jelű mutánst vagy annak neomicint termelő valamely mutánsát vagy variánsát használják. Ismeretes, hogy a neomicin - elsősorban széleskörű állatgyógyászati felhasználásának köszönhetően - egyike a legnagyobb mennyiségben előállított amino-glikozid típusú antibiotikumnak. Előállításával számos szabadalmi leírás foglalkozik (788.972 számú nagy-britanniai, 150.473 és 175.050 számú magyar, 112.577 számú csehszlovák, 3.352.761 és 3.386.889 számú egyesült államokbeli, 68.565 számú román szabadalmi leírás). A gazdaságosabb gyártás érdekében egyre nagyobb hozamú technológiákat dolgoznak ki, melyek elsősorban a törzs termelőképességének növelésén, és a technológiai feltételek optimalizálásán alapulnak. A szakirodalomból ismert eljárások által elért legmagasabb fermentációs hozam 18.700 ng/ml (175.050 sz. magyar szabadalmi leírás) illetve 18.000-19.000 jug/ml (68.565 sz. román szabadalmi leírás) értéknek felel meg. Eljárásunk alapja az a felismerés, hogy az NR-8/51 jelű, kumarin-ultraibolya sugárzás kombinált hatással előállított mutáns törzsünk, megváltozott genetikai tulajdonsága következtében, az eddig ismerteknél magasabb neomicin termelő képességgel rendelkezik. Az NR-8/51 jelű mutánst az alábbiakban 5 ismertetett eljárás szerint állítottunk elő: Az (N-39/43-1) jelzésű törzsből készített spóraszuszpenziót 0,02 t% koncentrációjú kuniarin oldatban élőinkubáltuk, majd Philips TUV-40-es sugárforrást használva 30 cm tá- 10 volságból besugároztuk. Az időnként kivett, és táptalajra beoltott mintákból azokat használtuk fel, amelyek azonos dózist kaptak, mint azok a kumarinnal nem kezelt kontroll minták, melyeknél a túlélés csak 0,1% volt. 15 Kumarin jelenlétében ez a túlélés 0,3%-ra emelkedett, valamijét a kumarinnal kezelt mintából izolált egysejtkultúráknól megnövekedett a pozitív termelőképességű mutánsok aránya a kontrol mintához viszonyítva. Az 20 így izolált kiemelkedő neomicin termelőképességű NR-8/51 jelű törzset streptomycin tartalmú tápagaron szélesztettük, hogy e magas termelőképességet stabilan megőrző utódokat kiválogathassuk. 25 A továbbiakban az így kiválasztott törzzsel dolgoztunk, melyet az Országos Közegészségügyi Intézetben MNG-00313 szám alatt deponáltak. További célunk az volt, hogy a fermen- 30 tációs technológia optimalizálásával az NR-8/51 jelű törzs neomicin termelési szintjét növeljük. E munka során vizsgáltuk az általunk izolált törzs hatóanyagtermelését a táptalaj- 35 koncentráció változtatásának és az oxigénellátás (levegőztetés) mértékének függvényében. A különböző kísérleti körülmények között elért hatóanyagkoncentrációkat az 1. táblázatban tüntettük fel. 1. táblázat \ Rázott fermentációkban elért fermentációs szintek (pg/ml) Törzs jele Táptalaj jele NF-6 NF-8 60 ml 35 ml 60 ml 35 ml N-39/43-1 18.200 18.200 17.600 18.600 NR-8/51 19.300 21.000 18.300 22.900 A 1. táblázatban feltüntetett eredményeket laboratóriumi léptékű, ún. rázott fermentációkban értük el. A megadott térfogatok az 500 ml-es Erlenmayer lombikban lévő táptalaj térfogatát jelölik. A 60 ml táptalaj közepes levegőztetést, a 35 ml táptalaj intenzív levegőztetést biztosit. Az NF-8 jelű táptalaj koncentrált, az NF-6 jelű kevésbé koncentrált táptalaj összetételnek felel meg. A táptalajok pontos összetételét a 2. táblázatban (8. oldali adtuk meg. 55 Az 1. táblázat adataiból látható, hogy az NR-8/51 jelű törzs hatóanyagtermelése jelentősen nő ha a táptalajban a nitrogénforrás és szénhidrátforrás koncentrációját növeljük. Ez a növekedés azonban csak akkor követ- 60 kezik be, ha egyúttal az intenzívebb oxigénellátást is biztosítani tudjuk. Nem kielégítő levegőztetés esetén a táptalajkoncentráció növelésével ellenkező hatást értünk el, a törzs halóanyagtermelése csökkent. Kisérlete- 65 ink alapján arra a felismerésre jutottunk, 3
