196458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinkifejeződés fokozására a trp-operon Shine-Dalgarno-szekvencia és startkodon közötti DNS-szekvenciájának megváltoztatásával
6 196458 7 végezzük az átalakítást. Az inkubáció befejezése után az inkubációs elegyet fenollal extraháljuk, a szerves fázist elválasztjuk, és a DNS-t két és félszeres Lérfogatú etanol adagolásával és -20 °C-on két végzett inkubálással kicsapjuk. Centrifugálás után a DNS-t alkálikus foszfatázzal (Boehringer Mannheim) kezeljük az 5’-foszfát-maradékok eltávolítása érdekében. A szintetikusan előállított (IX) oligonukleotiotidot 5’ CGACCATGGT 3' (IX) polinukleotid-kinázzal és ATP-vel foszforilezzük az 5’-végen. Ehhez a szintetikus oligonukleotidot 5 percre 70 °C-ra melegítjük, majd rögtön jeges fürdőbe lehűtjük. A foszforilezést 25 pl pufferben (50 mmól/1 Tris-HC1, pH 7,6; 10 mmól/1 MgCte, 5 mmól/1 ditiotreitol (DTT) 100 pmól ATP és mintegy 10 egység T4-polinukleotid-kináz adagolása mellett, 37 °C-on 30 perc alatt végezzük. A reakciót etilén-diamintetraecetsavas nátrium (EDTA) adagolásával (50 mmól/1 végső koncentrációig) állítjuk le. A fölösleges ATP-t elválaszthatjuk, például SepharoseK (SEPHADEX G 50, finom) oszlopon végzett gélszüréssel. A (IX) oligonukleotid ön-komplementer, és (X) szerkezetűvé 5’ CGACCATGGT 3’ (X) TGGTACCAGC asszociálódhat. Ennek a (X) oligonukleotidnak túlnyúló végei vannak, amelyek a megnyitott ptrplLl plazinid Cla I helyeire való beépítést tesznek lehetővé. Mintegy 5 ng oligonukleotidot kb. 1 pg átalakított, foszfatázzal kezelt plazmiddal 30 pl pufferben (50 mmól/1 Tris-HCI, pH 7,4; 10 mmól/1, MgClz, 10 mmól/1 DTT) 1 mmól ATP és 0,1 mg/ml szarvasmarha szérum albumin (RSA) adagolása mellett 12 °C-on 20 óra hosszat inkubálunk. Így a pH 131/5 plazmidot kapjuk (1. ábra). A rfeakcióelegyet közvetlenül felhasználhatjuk komplementer E. coli sejtek transzformálására. A szelekciót 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-leves-agaron (H. J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972) végezzük. Mivel a pH 131/5 plazmidba egy Nco I vágóhely.et iktatunk be, az ampicillin-rezisztens kolóniákat arra nézve vizsgáltuk, hogy a jelen levő plazmid DNS tartalmaz-e egy kb. 300 bp hosszúságú Hind III-Nco I-fragmenst. A kolóniáknak mintegy 80%-a tartalmazza ezt a fragmenst. A Maxam-Gilbert szerint végzett szekvenciaanalízis igazolja a szintetikus DNS-fragmens beépítését és a pH 131/5 plazmidnak az 1. ábrán bemutatott szekvenciáját. 2. péida A 3 419 995. sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban ismertetett, és az 5. ábrán bemutatott p 159/6 plazmidot az előállító javaslata alapján EcoRI és Sal I enzimmel inkubáljuk, és gélelektroforézissel egy 420 bp hosszúságú DNS-fragmenst választunk el, amely a humán interleukin-2 genetikai információját tartalmazza. Az egyszálú túlnyúló végeket Mung-Bean-nukleázzal (Pharmacia P-L Biochemicals) az előállító által javasolt körülmények között lebontjuk. A pH 131/5 plazmidot Nco 1 enzimmel kezeljük, és a túlnyúló egyszálú végeket szintén Mung-Bean-nukleázzal lebontjuk. Végül a most már tompavégű interleukin-2 strukturgént a tompavégü alakított nyitott plezmidba építjük DNS-ligázzal .blunt end" körülmények között. így a Nco I vágóhelyeket visszaalakítjuk. Az E. coli 294-be történő transzformálás után szelektáljuk az ampicillin-rezisztens kiónokat, amelyek megfelelő restrikciós fragmenseket tartalmaznak, például egy kb. 260 bp hosszúságú Eco Rl-Xba I-fragmenst vagy egy kb. 150 bp hosszúságú Eco RI-Sac I-fragmenst. A pH 185/11 plazmid nukleotidszekvenciáját (2. ábra) szekvencia-analízis igazolja. Ennél a konstrukciónál az Nco I restrikciós helyek megmaradnak. Az interleukin-2 expressziójához E. coli 291 baktériumokat, amelyek a pH 185/11 plazmidot tartalmazzák, LB-tápközegben (H. J. Miller, id. h.) 50 ul/ml ampicillin jelenlétében éjszakén át, levegőztetés mellett inkubálunk. Ezután 1 : 100 higítást készítünk 1 ug/ml tiamint és 500 ug/ml savval hidrolizált kazeint tartalmazó M9 tópközeggel (H. J. Miller, id. h) OD = 0,5-nél indolil-3-akrilsavval, 15 ul/ml végső koncentrációig indukálható. További 2-3 óra múlva a baktériumokat centrifugáljuk. SDS-gélelektroforézissel az in lukált baktériumoknál erős , proteinsáv figyelhető meg, amely a 3 419 995. sz. NSZK-beli közrebocsátási irat szerinti interleukin-2 elleni antitestekkel reagál. A sáv megfelel az interleukin-2 vért molekulatömegének, és a nem-indukált baktériumoknál nem fordul elő. Az interleukin-2 biológiai aktivitása nagy koncentrációnál az indukált baktériumokban kimutatható. A baktériumok tenyésztésére megadott fenti körülmények rázólombikokra érvényesek. Nagyobb OD-értékig (3 fölött) történő fermentáció esetén nagyobb kazein és/vagy L-triplofán koncentráció szükséges. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
