196458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinkifejeződés fokozására a trp-operon Shine-Dalgarno-szekvencia és startkodon közötti DNS-szekvenciájának megváltoztatásával
8 196458 9 3. példa Humán ű-interferon strukturgénje egy cDNS-bankból származik. A kiónok a beépített részt a pBR 322 Pst I helynél tartalmaz- 5 zák. Hinf I és Pst I restrikciós enzimekkel a Ű-interferon strukturgénjéböl egy olyan 120 bp hosszúságú részt izolálunk, amely az 5’-végén Hinf I szekvenciát tartalmaz. Itt a Hinf I hely feismerő szekvenciája a biológi- '0 ailag aktív ű-interferon N-termiriális metioninjának kodonja után 16 nukleotiddal kezdődik. A szintetikusan kapott (XI) oligonukleotidot 15 5’ CATGAGCTACAATCTTCTTGG 3’ (XI) 3’ TCGATGTTAGAAGAACCTAA 5’ Nco I Hinf I DNS-ligázzal a fenti 120 bp hosszúságú frag- 20 mens Hinf I végéhez adjuk. így a (XII) DNS-részletet kapjuk. A ű-interferon strukturgénjéböl Pst I és Bgl II segítségével egy 365 pb hosszúságú DNS-részletet izolálunk. Ezt a részletet a 25 kereskedelemben kapható pUC 12 plazmidba klónozzuk, amelyet előzőleg Pst I és Bam Hl segítségével kezeltünk. így a pH 188 plazmidot kapjuk. Amplifikálás és újraizolálás után a pH 188 plazmidot Pst I és Eco Rí jelenlété- 10 ben inkubáljuk, és a ű-interferon-génfragmenst izoláljuk (XIII DNS-részlet). A pH 131/5 plazmidot Nco I és Eco Rí restrikciós enzimekkel kezeljük. Végül a (XII) és (XIII) DNS-részleteket a megnyitott 35 plazmiddal DNS-ligáz jelenlétében olyan körülmények között inkubáljuk, amelyek a kötések kovalens kapcsolódását eredményezik. Restrikciós és szekvencia analízissel a várt szekvenciát igazoljuk a pH 192/5 plazmidban 40 (3. ábra) A ű-interferon expressziójához a 2. példához hasonnló módon járunk el. Indukció után itt is jelentős sáv figyelhető meg az elektroforézis gélen, amely a nem-indukált 45 baktériumoknál nem jelenik meg. A baktérium-extraktumban a ű-interferon biológiai aktivitása kimutatható. A pH 131/5 plazmid Nco I helyeire a 2. példa szerinti módon az interleukin-2 struk- 50 turgénjét építjük be. A plazmidot Eco RI-vel kezeljük, majd a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal dezoxi-adenozin-trifoszfát és dezoxi-timidin-trifoszfát jelenlétében végzett inkubálással tompavégü alakítjuk. 55 A kereskedelemben kapható (Pharmacia P-L Biochemicals) trp-operon terminátort ebbe a megnyitott, tompavégű plazmidba .blunt end" körülmények között, egyidejű gyúrüzárás mellett beépítjük. 60 A baktériumok növesztése és inkubálása után, a 2. példában és az előzőekben leírt módon, a baktériumokat elválasztjuk és lizáljuk. SDS-gélelektroforézis az interleukiri-2- -proteinek sávjait változatlanul mutatja, a 2. 65 példával azonos intenzitással. A ű-laktamáznak megfelelő sávok azonban lényegesen kisebb intenzitást mutatnak. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás E. coli trp-expressziós rendszerrel rendelkező vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy E. coli vektort, amely a Shine-Dalgarno-szekvencia után (I) DNS-szekvenciát 5’ GTATCGACC 3' (I) (kódoló szál) és azt követő 5’ ATG& 3’ szekvenciát tartalmaz, Nco I restrikciós enzimmel vágjuk, és a) a vágási helyre egy (II) DNS-szekvenciájú 5’ CATGX ... 3’ (II) 3’ Y ... 5’- ahol X és Y egy strukturgén startkodonja utáni első komplementer nukleotidpárt jelenti- génstruktúrát ligálunk, vagy b) a vágási helyet enzimatikusan feltöltjük, és a (III) szekvenciájú DNS-t 5’ GTA TCG ACC ATG 3’ (III) 3’ CAT AGO TGG TAC 5’ egy (IV) szekvenciájú DNS-sel 5’ X .. .. 3’ 3’ Y .. .. 5’- ahol X és Y jelentése a fenti - ligáljuk, vagy c) a vágási helyek túlnyúló szekvenciáit enzimatikusan lebontjuk, és a (VI) DNS-szekvenciát 5' GTA TCG AC 3’ (VI) 3’ CAT AGC TG 5’ egy (VII) szekvenciájú DSN-sel 5’ Z ATG X ... 3’ (VII) 3’ Z’TAC Y ... 5’ ligáljuk - ahol Z és Z’ egy tetszés szerinti nukleotidpárt jelent, amely ki is maradhat, X és Y jelentése a fenti. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) DNS szekvencia az 5’-végén közvetlenül az AAGG Shine-Dalgarno-szekvenciához kapcsolódik, és az 5’ ATGG 3’ szekvenciában a G nukleotid egy struktúrgénnek az ATG startkodon utáni első nukleotidja. 3. Eljárás polipeptid előállítására genetikailag kódolható aminosavakból, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással előállított vektorba a polipeptidet kódoló struktúrgént beépítjük, az igy transzformált vektort E. coliba transzformáljuk, a transzformáns törzset megfelelő tápközegen tenyésztjük, és a polipeptidel a fermentléből elkülönítjük. 2 rajz A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 89.1252.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
