196458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinkifejeződés fokozására a trp-operon Shine-Dalgarno-szekvencia és startkodon közötti DNS-szekvenciájának megváltoztatásával
4 196458 5 az előnyt jelenti, hogy a strukturgén kifejeződése meglepő mértékben fokozódik. A találmány egy másik tárgya eljárás E. coliból származó trp-expressziós rendszerrel rendelkező vektor előállítására. A találmány értelmében E. coli vektort, amely az (I) DNS-szekvenciát (kódoló szál) és azt követő 5' ATGG 3’ szekvenciát tartalmaz, Nco I restrikciós enzimmel vágunk, és a) a vágási helyre egy, (II) DNS-szekvenciájú génstruktúrát ligálunk, vagy b) a vágási helyet enzimatikusan feltöltjük, és a (III) szekvenciájú DNS-t a (IV) szekvenciájú DNS-sel ligáljuk, vagy c) a vágási hely túlnyúló szekvenciáját enzimatikusan lebontjuk, és a (VI) szekvenciájú DNS-t a (VII) szekvenciájú DNS-sel ligáljuk. A találmány további tárgya eljárás E. coli gazdaszervezetek előállítására, amelyek a találmány szerinti eljárással előállítható vektort tartalmazzák. A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptidek előállítására genetikailag kódolható aminosavakból oly módon, hogy a találmány szerinti vektorokkal transzformált E. coli sejteket ismert módon expresszióra bírjuk. A találmány további tárgyát is előnyös kiviteli módját a következőkben közelebbről megvilágítjuk, és az igénypontokban rögzítjük. Az 1-3. ábra közelebbről megvilágítja a kiviteli példákat. így az 1. ábra pH 131/5 plazmid előállítását mutatja az ismert ptrpL 1 plazmidból. A 2. ábra az interleukin-2-t kódoló pH 185/11 plazmid előállítását mutatja az ismert p 159/6 plazmidból és a pH 131/5 plazmidból (1. ábra). Végül a 3. ábra a Ű-interferont kódoló pH 192/5 plazmidot mutatja. A találmány egy különleges továbbfejlesztése az, amikor a vektor ampicillin-rezisztenciát a ß-laktamäz-promoterrel ugyanolyan orientációban tartalmaz, mint a trp-promoter. Meglepő módon kiderült ugyanis, hogy a módosított trp-operon következtében nem csak . a startkodon után elhelyezkedő gén nagyon erős expressziója következik be, hanem a ß-laktamaz is indukálódik. A 0-laktamáz magasabb koncentrációja az ampicillin magasabb koncentrációja elleni rezisztenciát eredményezi, miáltal egy további szelekciós lehetőség nyílik meg. Ezáltal lehetővé válik, hogy a különösen előnyös promotermutációkat, sőt a riboszóma kötőhely területén levő nukleotidvariációkat minden egyes kifejezendő proteinnél gyorsan ellenőrizzünk. Ha a jB-laktamáz egyidejű képződése nem kívánatos, de az ampicillin rezisztenciával rendelkező vektorokat ki akarjuk használni, akkor ezt elnyomhatjuk egy terminator beépítésével az előállítandó protein Strukturgénje és a /3-laktamáz strukturgénje közé. Ennek megfelelően a találmány egy további továbbfejlesztése abban áll, hogy a nevezett gének közé egy alkalmas terminátort, előnyö- 4 sen egy bakteriális terminátort építünk be. Különösen előnyös a trp-operon terminátora, amelyet alkalmas helyre építünk be, például a strukturgén stopkodonja (vagy stopkodonjai) után 10-20 nukleotidnál vagy közvetlenül a ű-laktamáz-operonnál. A találmány szerinti trp-promoter/operátor génkonstrukció minden, E. coliban replikálódó plazmidba beépíthető. Előnyösen a kereskedelemben kapható E. coli vektorokat, pl. pBR 322, pBR 325, pACYC 1Y7, pACYC 184, pUC 8 és ezek származékait használjuk. Származékként olyan plazmidok jöhetnek számításba, amelyekből esszenciális területeket eltávolítottunk, vágóhelyeket vagy markerokat beépítettünk vagy megváltoztattunk. A (II), (IV), (V), (VII) és (VIII) génszekvenciák az XY nukleotidpárral egy tetszés szerinti strukturgén kezdetét tartalmazzák, például először egy a gazdaszervezet saját génjét, amely egy proteint kódol, amely a periplazmatikus térbe történő transzportra vagy a sejtmembránra hat. Ilyen módon fúziós proteinek állíthatók elő, amelyek a plazmából elLávolíthaLók, és így könnyen izolálhatok, és/vagy a sejt saját enzimjeivel a lebomlástól védhetők. Előállíthatok azonban olyan fúziós proteinek is, amelyek oldhatatlanságuk következtében a sejt saját proteinjeitől könnyen elválaszthatók. Ezen kívül lehetséges a kívánt proteineket közvetlenül kifejezni, ha a strukturgént közvetlenül az ATG stratkodon mögé építjük be. A találmány szerinti eljárással nyerhető polipeptidek például az inzulin, interferonok, interleukinok, pl. interleukin-2, hirudin vagy a szomatosztatin. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. Az egyes eljárási lépések vonatkozásában utalunk Maniatis és munkatársai, .Molecular Cloning' című tankönyvére [Cold Spring Harbor (1982)1. 1. példa Kromoszomális E. coli DNS-t Hinf I-vel hasítunk, és a 492 bp-os fragmenst izoláljuk, amely a trp-operátorból a promotert, operátort, az L-peptid strukturgénjét, az attenuátort és a trp-E-strukturgén első hat aminosavjónak kodonját tartalmazza. Ezt a fragmenst Klenow-polimeráz segítségével dezöxi-nukleotid-trií'oszfátokkal töltjük fel, mindkét végen olyan oligonukleotidhoz kötjük, amely Hind III felismerőhelyet tartalmaz, és Hind Ill-mal vágjuk. Az így kapott Hind III fragmenst pBR 322 plazmid Hind III vágóheiyeire ligáljuk. így a ptrpE2-l plazmidot kapjuk (J. C. Edmann és munkatársai, id. h.). Ezt az ott ismertetett módon ptrpL 1 plazmiddá alakítjuk. A fenti kiindulási termék találmány szerinLi vektorrá alakításához az előállítók (New England Biolabs) javaslata szerint Cla I-vei 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65
