196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
14 196457 15 tékben hibridizált ezzel az izotóppal jelzett restrikciós töredékkel. Ezen túlmenően, az izotóppal jelzett, 260 bázispárból álló töredéket felhasználtuk 4000 különböző, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformálással nyert termék hasonló módon történő független vizsgálatára. 50 olyan tenyészetet azonosítottunk, amely különböző mértékben hibridizált ennél a vizsgálatnál. Az egyik a LelF G töredéket tartalmazta, egy másik a LelF H töredéket, egy további a LelF Hl jelzéssel ellátott töredéket tartalmazta, amely a LelF H-nak nyilvánvalóan megfelelő alléi változat. A képződő hibrid plazmidokat .pLelF H" stb. megjelöléssel láttuk el. G. Az első teljes hosszúságú LelF gén elkülönítése és a szekvenciák meghatározása Plazmid DNS-at állítottunk elő mind a 39 lehetséges LelF cDNS kiónból és ismételt vizsgálatot végeztünk ugyanazzal a 260 bázispárból álló DNS töredékkel, Kafatos és munkatársai hibridizációs ejárását alkalmazva (lásd fentebb). Három plazmid (pL4, pL31, pL34) igen erős hibridizációs jelet adott, négy plazmid (pL13, pL30, pL32, pL36) közepesen hibridizált, három plazmid (pL6, pL8, pL14) pedig gyengén hibridizált a DNS töredékkel. A 39 lehetséges LelF cDNS rekombinációs plazmidot olyan vizsgálatnak is alávetettük, amelynek során 32P izotóppal jelzett szintetikus undekamereket (egyes T-l alaprészcsoportok vagy egyes T-13 alaprészek) közvetlenül használtunk a hibridizációhoz. A hibridizáció körülményeit úgy választottuk meg, hogy csak tökéletes bázispárositás esetén lehessen kimutatni a hibridizációs jeleket (Wallace és munkatársai, Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 /1979/). Tehát a 39 klónból a plazmid DNS-at hagyományos elbontással állítottuk elő (Clewell és munkatársai, lásd fentebb), és Biorad Agai’ose A-50 oszlopon végzett kromatográfiával tisztítottuk. Mindegyikből 3-3 jug mintát lineárissá tettünk EcoRI enzimmel való kezeléssel, lúgban denaturáltuk és két különálló nitrocellulóz szűrőre vittük fel, 1,5 jug mennyiséget egy-egy szűrőre (Kafatos és munkatársai, lásd fentebb). Az egyes szintetikus dezoxioligonukleotid alaprészeket és alaprészegyütteseket a következőképpen foszforileztük (gamma 32P) ATP-tal (ATP = adenozin-trifoszfát): 50 pmól oligonukleotidot és 100 pmól (gamma 32P) ATP-ot (New England Nuclear, 2500 Ci/mól) 30 m1 50 mM trisz-hidrokloriddal, 10 mM magnézium-kloriddal és 15 mM béta-merkapto-etanollal elegyítettünk. 2 egység T4 polinukleotid kinázt adtunk hozzá, majd az elegyet 30 percig tartottuk 37 °C-on. A 32P izotóppal jelzett alaprészeket 10 ml térfogatú, Sephadex(R> G-50 töltetet tartalmazó oszlopokon végzett kromatográfiával tisztítottuk. A hibridizációkat 106 cpm T-13C alaprész vagy 3 x 106 cpm T-1C alaprész alkalmazáséval hajtottuk végre, 15 °C-on 14 órán át, Wallace és munkatársai eljárása szerint (lásd fentebb), 6 x SSC-oldatban (1 x SSC-oldat összetétele: 0,15 M nétrium-klorid, 0,015 M nátrium-citrét, pH = 7,2) és 10 x Denhardt-oldatban (0,2% szarvasmarha szérumalbumin, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% Ficoll). A szűrőket 5 percig mostuk (háromszor) 0 °C-on 6 x SSC-oldattal, szárítottuk és röntgenfilmet tettünk ki az anyag gammasugárzása behatásának. A kapott eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be a 32P izotóppal jelzett T-13C alaprészegyüttesre és a T-1C alaprészre vonatkozólag. Azt tapasztaltuk, hogy a 104. számú kióntól származó plazmid DNS jelentős mértékben hibridizálódott a T-1C alarészegyüttessel és a T-13C alaprésszel, nem mutatott azonban észrevehető hibridizációt a többi urdekamerrel. Amint az a 2. ábrán látható, a 39 lehetséges LelF plazmid közül több (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) szintén hibridizálódott mindkét aiaprésztipussal. A restrikciós analízis azonban azt mutatta, hogy e plazmidok kezűi az egyik (pL31) egy 260 bázispárból álló belső BglII töredéket is tartalmazott. A pl 31 plazmid PstI enzimmel végzett feltárása azt az eredményt szolgáltatta, hogy a cDNS beillesztés mérete közelítőleg 1000 bázispár. A pL31 plazmidban lévő egész PstI beillesztés szekvenciáit meghatároztuk, mind a Maxam-Gilbert-féle kémiai módszerrel (Methods Enzymol.,' 65, 499-560 /1980/), mind ivedig a didezoxi-lánclezáró eljárással (Smith, Methods Enzymol., 65, 560-580 /1980/), a Sau3a töredékek M13 vektorba történő alklónczását követően. A DNS szekvencia a 3. ábrán látható (.A"). A lefordítást megszabó megfelelő .leolvasó keret" a rendelkezésre álló fehérje szekvenciákból, az ismert LelF molekulasúlyokból és a három lehetséges leolvasó keretben lévő megállító triplettek viszonylagos elterjedtségéből állapítható meg. E leolvasó keret viszont lehetővé tette az egész LelF aminosav szekvenciájának a meghatározását, beleértve az elő- vagy jel peptidet is. Az első ATG lefordítást kiváltó kodonban 60 nukleotidot találtunk, a szekvencia 5’ végétől kezdve, majd 188 kodon után egy TGA lezáró triplett következett. 342 leforditatlan nukleotid volt a 3’ végen, majd egy poli(A) szekvencia következett. A feltételezett jel peptid (amely feltehetően részt vesz az érett leukocita interferonnak a fehérvérsejtekből való kiválasztásában) 23 aminosav hosszúsági!;. Az érett leukocita interferont felépítő 165 aminosav számított molekulasúlya 19390. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
