196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
16 196457 17 A pL31 plazmid által kódolt leukocita interferont .LelF A" jelöléssel láttuk el. A szekvenciákra vonatkozó adatokból látható (4. ábra .A"), hogy a LelF B TI és T13 triptikus peptidjei a LelF A 145-149 illetve 57-61 számú aminosavjainak felelnek meg. Az ebben a két tartományban talált tényleges DNS kódoló szekvenciák a Tl-C alaprészegyüttessel és a T13-C alaprésszel jellemezhetők (lásd a 8. ábrát). H. Az érett leukocita interferon A (LelF A) közvetlen termelése Az az eljárás, amelyet a LelF A-nak mint érett interferon polipeptidnek a közvetlen kifejezése céljából követtünk, egy változata volt az emberi növelcedési hormon elöálitására leirt korábbi eljárásnak (Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544-548 /1979/), amennyiben mindkét eljárásnál szintetikus (N-végződésű) és kiegészítő DNS-ak összekapcsolásáról volt szó. Amint a 6. ábrán látható, egy Sau3a restrikciós endonukleáz hely célszerűen a LelF A 1. és 3. kodonja között helyezkedik el. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot választottunk ki, amelyek ATG lefordítást kiváltó kodont tartalmaznak, helyreállítják az 1. számú aminosavra (cisztein! vonatkozó kodont és EcoRI .tapadás" (sticky) véget hoznak létre. Ezeket az oligomereket a pL31 plazmid 34 bázispárból álló, Sau3a és Avail közötti töredékéhez kapcsoltuk. A képződött, 45 bázispárból álló terméket két további DNS töredékhez kapcsoltuk. Ily módon egy 865 bázispárból álló, szintetikus/természetes eredetű hibrid gén képződött, amely a LelF A-t kódolja, és amelyet megkötnek az EcoRI és PstI restrikciós helyek. Ezt a gént beillesztettük a pBR322 plazmidba az EcoRI és PstI helyek közé. így a pLeiF A1 plazmidot kaptuk. A triptofén szabályozó elem kialakítása (A triptofán szabályozó elem Escherichia coli triptofán /trp/ promotort, operátort és trp vezető riboszóma kötési helyet tartalmaz, nélkülözi azonban a lefordítás kiváltásához szükséges ATG szekvenciát.) A pGMI plazmid (ATCC 31622) hordozza a aLE1413 törlést tartalmazó Escherichia coli triptofán operont (Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 133, 1457-1466 /1978/), és ennek következtében - a trp promotor-operátor rendszer irányítása alatt - olyan öszszekapcsolt fehérjét termel, amely magába foglalja a trp vezető első hat aminosavját és a trp E polipeptidnek mintegy utolsó harmadét (az a továbbiakban LE’ jelöléssel szerepel), valamint az egész trp D polipeptidet. 20 Mg pGMI plazmidot feltártunk a Pvull restrikciós enzimmel, amely öt helyen hasítja a plazmidot. A géntöredékeket ezután EcoRI összekapcsolókkal kapcsoltuk össze (ezek egy önkiegészitő oligonukleotidból állnak, amely szekvenciája pCATGAATTCATG) és igy egy EcoRI hasítási hely jött létre, amelyet később egy EcoRI helyet tartalmazó plazmidba lehetett klónozni. A pGMI plazmidból nyert 20 Mg mennyiségű DNS töredékeket 10 egység T4 DNS-ligázzal kezeltük 200 pmól mennyiségű, az 5’ végén foszforilezett szintetikus oligonukleotid (pCATGAATTCATG) és 20 m1 T4 DNS-ljgáz pufferoldat (összetétele: 20 mM trisz, pH = 7,6; 0,5 mM adenozin-trifoszfát, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM ditiotreitol) jelenlétében, 4 °C-on, egy éjszakén át. Az oldatot ezután 10 percig hevítettük 70 °C-on az öszszekapcsolás megállítása céljából. Az összekapcsolókat EcoRI feltárással lehasitottuk és a töredéketet - amelyek most EcoRI végeket tartalmaztak - szétválasztottuk 5%-os poliakrilamidgél-elektroforézissel (PAGE). A három legnagyobb töredéket különítettük el a gélről, úgy, hogy először etidium-bromiddal megfestettük, ultraibolya fénnyel történő megvilágításnál a töredékek elhelyezkedését meghatároztuk, és levágtuk a gélből az elkülöníteni kívánt anyagot tartalmazó részeket. Az egyes géntöredékeket tartalmazó géldarabokat 300 pl 0,1 x TBE pufferoldattal együtt dializáló zsákba helyeztük és 1 órán át végeztünk elektroforézist 100 V feszültséggel 0,1 x TBE pufferoldatban. (A TBE pufferoldat összetétele: 10,8 g trisz bázis, 5,5 g bórsav, 0,09 g etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó 1 liter vízben.) A dializáló zsákból a yízes oldatot eltávolitottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk és 0,2 M nátrium-klorid-koncentrációt állítottunk be. A DNS-at etanolos kicsapással nyertük ki a vizes közegből. A trp promotor-operétor rendszert tartalmazó, EcoRI tapadós végekkel ellátott gént az alábbiakban ismertetett módon azonosítottuk. A töredékeket tetraciklinre érzékeny plazmidba illesztettük, amely a promotor-operátor beillesztése után ellenállóvá vált tetraciklinnel szemben. A pBRHI plazmid (Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Res., 6, 3267-3287 /1979/) ampicillinnel szembeni rezisztenciát hoz létre, és tartalmazza a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, azonban ehhez kapcsolódó promotor hiányában nem hozza létre ezt a rezisztenciát. Ennek megfelelően a plazmid érzékeny tetraciklinre. Ha beviszünk egy promotor-operátor rendszert az EcoRI helyre, a plazmid rezisztenssé válik tetraciklinnel szemben. A pBRHI plazmidot (ATCC 37070) EcoRI enzimmel feltártuk, és az enzimet fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval eltávolitottuk. A terméket etanolos kicsapás után vizes közegből nyertük ki. A DNS molekulát külön-külón a fenti három DNS töredék mindegyikével összekapcsoltuk, és az előbbi5 10 15 20 25 30 35 10 45 50 55 60 65 10
