196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
4 196457 5 folytén létrejövő heterológ gének vagy géntöredékek beilleszthetők a plazmidba, úgy, hogy a végek kapcsolódnak a hasítási helyhez vagy az azzal szomszédos újjáalakult véghez. A DNS-rekombinéciót a sejten kívül végzik, a létrehozott .rekombinéns' plazmid azonban bevihető a sejtbe a transzformációnak nevezett eljárással, és nagy mennyiségben nyerhető heterológ gént tartalmazó rekorabinált palzmid a transzformációval kapott sejtek szaporításával. Továbbá, ha megfelelően történt a gén beillesztése a plazmid azon részeihez képest, amelyek a DNS-ben kódolt információ átírását (transcription) és lefordítását (translation) szabályozzák, akkor a kapott termelő közeg felhasználható annak a polipeptid szekvenciának a tényleges termeléséibe, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejezésnek is nevezik. A polipeptid előállítása (kifejezése) a promotor néven ismert tartományban indul be, amelyet a ribonukleinsav (RNS) polimeráz ismer fel és kötődik hozzá. Egyes esetekben, például a találmánnyal kapcsolatban előnyös triptofán (trp) promotor esetében, a promoter tartományokat átfedik az .operátor" tartományok, és igy kombinált promotor-operátor jön létre. Az operátorok olyan DNS szekvenciák, amelyeket felismernek az úgynevezett represszor fehérjék, amelyek arra szolgálnak, hogy szabályozzák az átírás beindulásának gyakoriságát egy bizonyos promotornál. A polimeráz enzim végighalad a DNS mentén, és átírja a kódolt spirálágban az 5’ végétől a 3’ végéig tárolt információt üzenethordozó ribonukleinsavvá (mRNS), amely viszont átalakul a DNS által kódolt aminosav-szekvenciájú polipeptiddé. Minden egyes aminosavat egy nukleotid triplett vagy .kodon" kódol azon belül, amelyet a szabadalmi leírás céljaira szerkezeti génnek nevezünk. Ez az a rész, amely a létrehozott termék aminosav-szekvenciáját kódolja. A promotorhoz történő kötődés után az RNS polimeráz először átírja azokat a nukleotidokat, amelyek egy riboszóma kötési helyet kódolnak, majd a lefordítás kiváltása vagy .startjel" következik (ez rendszerint ATG /adenin-timin-guanin/, amely a létrejövő üzenethordozó ribonukleinsavban AUG-vé alakul), azután pedig a nukleotid kodonok jönnek létre magában a szerkezeti génben. Úgynevezett megállító kodonok kerülnek a szerkezeti gén végére, amelyek után a polimeráz további üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS) szekvenciát hozhat létre. A megállítójel miatt ezt nem fordítják le a riboszómák. A riboszómák az üzenethordozó ribonukleinsavon található kötési helyhez kapcsolódnak, és létrehozzák a kódolt polipeptidet, a lefordítás startjelétől kezdve a fentebb említett megállítójelig, h kívánt termék akkor képződik, ha a riboszóma kötési helyét kódoló szekvenciák megfelelően helyezkednek el az AUG indító kodonhoz képest, és ha valamennyi többi kodon követi fázisban az indító kodont. A képződő terméket úgy különítik el, hogy a .gazda" sejtet elbontják és megfelelő tisztítást alkalmaznak a többi baktériumfehérje eltávolításéra. Megfigyeltük, hogy a DNS-rekombinációs technológia alkalmazása - azaz interferon gének beillesztése mikrobiológiai termelő közegekbe és termelése a mikrobiológiai génsfcabályozó elemek irányításával - a leghatékonyabb módon szolgáltat nagy mennyiségű leukocita interferont. Az igy nyert interferon - az emberi eredetű anyagtól eltérően - nem glikozilezett ugyan, felhasználható azonban sokféle vírusos és daganatos megbetegedés gyógyítására. A találmány szerint a következőképpen állítottuk elő az első leukocita gént: (1) Homogenitás eléréséig tisztított emberi leukocita interferon részleges aminosav-szekvenciáit felhasználtuk szintetikus DNS mintákból álló sorozatok létrehozáséhoz. Ezek kodonjai a részleges aminosav-szekvenciák kódolására képes összes lehetséges nukleotid-koinbinációnak megfelelnek. (2) Indukált üzenethordozó ribonukleinsav felhasználáséval kiegészítő dezoxiribonukleinsavat (cDNS) tartalmazó baktériumtelepek készletét készítettük el. Radioaktiv izotóppal jelzett más indukált mRNS-t hibridizáltunk a fenti telepekből származó cDNS- hez. A hibridizáló mRNS-t eluáltuk és megvizsgáltuk az interferonba történő lefordításra oocyta teszttel. A telepekből nyert plazmid DNS-t, amely ilyen módon interferon aktivitást váltott ki, tovább vizsgáltuk a fenti (1) pontban leírt mintákhoz való hibridizálásra. (3) A (2) pontban ismertetett műveletekkel párhuzamosan a plazmidokba bevitt, indukált mRNS eredetű cDNS-t felhasználtuk transzformáns telepek készletének előállítására. Az (1) pont szerinti mintákat alkalmaztuk a radioaktiv izotóppal jelzett egyszélú cDNS szintézisének beindítására, hibridizált minták létrehozása céljából. A szintetikus mintákat indukált mRNS-val, mint templáttal hibridizáltuk és a fordított átírással meghosszabbítottuk. Ekkor indukált, radioaktív izotóppal jelzett cDNS-t kaptunk. Az ilyen módon nyert, radioaktív izotóppal jelzett cDNS-hez hibridizált, telep-készletből származó kiónokat tovább tanulmányoztuk, hogy igazoljuk a teljes hosszúságú interferont kódoló gén jelenlétét. Az (1) vagy (2) pont szerint előállított bármilyen részleges hosszúságú, feltételezett góntöredék maga is felhasználható a teljes hosszúságú gén kimutatására. (4) A fentiek szerint nyert, teljes hoszszúságú gént szintetikus DNS alkalmazásával átalakítottuk, hogy eJtávolítsuk az esetleges vezető szekvenciát, amely megakadályozhatja 5 10 15 20 25 30 35 ■10 45 50 55 60 65 4
