196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
6 196457 7 az érett polipeptid mikrobiológiai kifejeződését, és hogy biztosítsuk a megfelelő elhelyezkedést a kifejeződő közvetítőben a startjelekhez és a mikrobiológiai promotor riboszóma kötési helyéhez képest. A termelt interferont ezután addig tisztítottuk, hogy lehetővé váljon az azonosítása és aktivitásának meghatározása. (5) A fentiek szerint készített interferon géntöredéket felhasználtuk hibridizációval más, részlegesen homológ leukocita interferonok kimutatásánoz. A DNS-rekombinációs eljárások fenti módon történő alkalmazásával jó kitermeléssel sikerült mikrobiológiai úton előállítani nagy tisztaságú, homológ, glikozílezetlen leukocita interferonokat, mint érett polipeptideket, gyakorlatilag a megfelelő előszekvencia vagy annak részei nélkül. Ezek az interferonok közvetlenül előállít hatók, elkülöníthetők és tisztíthatok, úgy, hogy a kapott termék felhasználható állatok és emberek vírusos vagy daganatos megbetegedéseinek kezelésére. Az eddig előállított interferonok hatékonyaknak bizonyultak az in vitro vizsgálatok tsorán, sőt, in vivo vizsgálatokban is. Ez utóbbiaknál az első alkalommal került felhasználásra mikrobiológiai úton termeit érett leukocita interferon. Az .érett leukocita interferon" kifejezésen a leírásban mikrobiológiai (például bakteriális) úton termelt interferon molekulát értünk, amely glikozil-csoportokat nem tartalmaz. A találmány szerinti érett leukocita interferon lefordítási startjel (ATG)-től azonnal kifejeződik, közvetlenül a természetes termék első aminosav kodonja előtt. Az .érett" polipeptid ennek következtében a szekvenciája első aminosav jaként az ATG által kódolt metioiunt tartalmazhat anélkül, hogy a jellege lényegesen megváltozna. Másrészt, a mikrobiológiai .gazda" átalakíthatja a lefordítás termékét, eltávolitva így a metionint. Az érett leukocita interferon egy összekapcsolt fehérjévé, együtt is képződhet, amely eltér a szokásos vezetőtől, s specifikus módon hasítható sejten belüli vagy sejten kívüli környezetben (lásd a 2 007 676 A sz. nagy-britanniai publikált szabadalmi leírást). Végül az érett interferon egy mikrobiológiai .jel" peptidhez kapcsolva is képződhet, amely az összekapcsolt terméket a sejtfalhoz szállítja, ahol a jel lekapcsolódik, és az érett polipeptid kiválasztódik. Az érett leukocita interferon .kifejeződés "-en olyan interferon molekula bakteriális vagy más mikrobiol giai úton történő termelését értjük, amely sem glikozil-csoportokat, sem olyan elöszekvenciát nem tartalmaz, amely azonnal kiváltja egy emberi leukocita interferon genom mRNS lefordítását. Egyes leukocita interferon fehérjéket úgy azonosítottunk, hogy meghatározott öszszetételű DNS gén ; 3. és 8. ábra) felhasználásával deduktív módon megállapítottuk az aminosav-szekvenciákat (4. és 9. ábra). Nyilvánvaló, hogy ezeknél az interferonoknál - ahogyan valamennyi, találmány szerinti leukocita interferon fehérjénél - természetes ailé)-változatok fordulnak elő. Ezeket a változatokat az jellemezheti, hogy egy vagy több aminosavban különbözik a teljes szekvencia, vagy a szekvenciában egy vagy több aroinosavat érintő kihagyások, helyettesitések, beillesztések, sorrendcserék vagy kiegészítések találhatók. A találmány minden egyes leukocita interferon fehérjénél (LelF) az egyes alléi változatokra is kiterjed, amelyeket LelF A - LelF J megjelöléssel látjuk el. Az ábrák leírása: Az 1. ábrán két olyan aminosav-szekvenciát ismertetünk, amely megtalálható volt valamennyi, emberi fehérvérsejtből elkülönített és homogénre tisztított interferonnál. A két aminosav-szekvenciát T-l illetve T-13 jelöléssel láttuk el. Az ezeket a peptideket kódoló összes lehetséges mRNS szekvenciát bemutatjuk, a megfelelő DNS szekvenciákkal együtt. Az A, T, G, C illetve U betű az adenin, timin, guanin, citozin illetve uracil bázisokat tartalmazó nukleotidokat jelöli. Az N betű az A, G, C és U nukleotidok bármelyikére vonatkozik. A polinukleotidok ábrázolása az 5’ (baloldali) végtől a 3’ (jobboldali) vég irányéba történik, a kétszálú (d.s.) DNS-nél pedig megfordítva az alsó vagy nem kódolt ágra vonatkozólag. A 2. ábrán 32P izotóppal jelzett szintetikus dezoxioligo-nukleotidokkal hibridizált LelF plazmidok autorádiogramja látható. A 3. ábra nyolc géntöredék nukleolid szekvenciáit mutatja be (a kódolt ágakat). Ezeket a géntöredékeket, amelyeket A ... H betűkkel jelöltük, leukocita interferonok előállításához történő felhasználásra különítettük el. Minden egyes leukocita interferonnál aláhúztuk az ATG lefordítás beindító kodont és a lezáró triplettet. A megállító kodonok vagy lezáró triplettek után 3’ leforditatlan tartományok következnek. A LelF A-ra vonatkozó teljes hosszúságú génből hiányzik egy kodon, amely megtalálható a többi feltüntetett interferonban, amint azt a 3. ábra harmadik A sora jelzi. Az 5’ leforditatlan tartomány megelőzi a vezető szekvenciáit. Az elkülönített E töredékből hiányzik a teljes vezető, tartalmazza azonban a vélt érett LelF E-re vonatkozó egész gént. Az elkülönített G töredékben nincs jelen az egész kódoló szekvencia. A 4. érán a nukleotid szekvenciák alapján meghatározott nyolc LelF fehérjét hasonlítjuk össze. Azokat az egy betűs 'rövidítéseket használjuk, amelyeket a 1UPAC-IUB biokémiai nomenklatúrával foglalkozó bizottsága ajánl: A (alanin), C (cisztein), D (aszparaginsav), E (glutaminsav), F (feniialanin), G (glicin), H 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
