196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
2 196457 3 A találmány a dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológiára vonatkozik, azaz a DNS-rekombinációs technológiánál alkalmazott eljárásokra és az ezekkel az eljárásokkal kapott termékekre. Közelebbről, a találmány tárgyát polipeptidek, pontosabban érett emberi leukocita interferonok, az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és az említett polipeptidek előállítására szolgáló eljárás képezik. A találmány az eljárás során alkalmazott termelő közegekre, az ezeket tartalmazó új mikroorganizmusokra és az előállításukra szolgáló eljárásokra is kiterjed. Azoknak a DNS-szekvenciáknak az előállítására is a találmány tárgyát képezi, amelyek az érett emberi leukocita interferon aminosav-szekvenciáit kódoló szekvenciákat tartalmaznak. Az emberi leukocita interferont (LelF) Isaacs és Lindenmann fedezte fel és állította először elő eléggé szennyezett csapadék alakjában (Proc. R. Soc., B 147, 258-267 /1958/; 3 699 222 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezután erőfeszítések történtek az anyag tisztítására és jellemzésére, s sikerült viszonylag homogén leukocita interferonokat előállítani egészséges vagy leukémiás személyek fehérvérsejtjeiből (2 947 134 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsájtási irat). Ezek az interferonok a kémiai szerkezetüket tekintve fehérjék, s az őket tartalmazó sejteket képesek a vírusokkal szemben ellenállóvá tenni. Ezen túlmenően, az interferon gátolhatja a sejtburjánzást és befolyásolhatja az immunreakciót. A fenti tulajdonságok ösztönzést adnak arra, hogy a leukocita interferont felhasználják a gyógyászatban vírusfertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésére. A leukocita interferonokat gyakorlatilag a homogenitás eléréséig tisztították (Rubinstein és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 640-644 /1979/; Zoon és munkatársai, idézett mű, 76, 5601-5605 /1979/), és hozzávetőleg a 17500-21000 közötti molekulasúly-tartományt adták meg. E készítmények fajlagos aktivitása igen nagy, 2 x 10s - - 1 x 109 egység/mg fehérje, kedvezőtlenül csekély azonban a sejttenyészetből való kinyerés hozama. A fehérjék aminosav-szekvenciájét feltáró módszerek fejlődése azonban lehetővé tette az interferonok aminosav-szekvenciáinak meghatározását (Zoon és munkatársai, Science, 207, 527 /1980/; Levy és munkatársai, Próc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5102-5104 /1980/). Jelenleg nem ismerjük még teljes pontossággal a glikozilezödést a különböző leukocita interferonoknál, annyit azonban tudunk, hogy az egyes interferonoknál nem csupán a glikozileződés közötti különbségek a felelősek a megfigyelt eltérő molekulasúlyokért. A leukocita interferonok között az aminosav-összetétel és aminosav-szekvencia szempontjából jelentős különbségek tapasztalhatók, és az aminosav-homoló gia egyes esetekben kisebb mértékű 80%-nál. A véradóktól származó fehérvérsejtekből elegendő homogén interferont lehetett ugyan elkülöníteni a szerkezet részleges jellemzéséhez és korlátozott mértékű klinikai vizsgálatokhoz, ilyen módon azonban nem állítható elő olyan mennyiségű interferon, amely a kiterjedt klinikai kipróbálásokhoz, majd pedig az azokat kővető profilaktikus és/vagy terápiás alkalmazásokhoz lenne szükséges. Ennek következtében az emberi fehérvérsejt-eredetű interferonoknak a daganatellenes és vírusellenes hatását feltáró klinikai vizsgálatok eddig elsősorban nyers (< 1% tisztaságú) készítményekre korlátozódtak, és az egyébként rendkívül költséges gyártáshoz szükséges hosszú idő késlelteti az anyag kiterjedt tanulmányozását. A DNS-rekombinációs eljárások létrehozásával lehetővé vált azonban igen sokféle hasznos polipeplid bakteriális úton történő szabályozott termelése. Már rendelkezésre állnak olyan, a DNS-rekombinációs eljárásokkal módosított baktériumok, amelyekkel például a következő polipeptidek állíthatók elő: szomatosztatin, az emberi inzulin A és B komponense és az emberi növekedési hormon (Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056- 1063 /1977/; Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544-548 /1979/L Újabban DNS-rekombinációs eljárással állították elő bakteriális úton a csecsemőmirigy által termelt, immunitást biztosító „timozin alfa 1’ anyagot és a proinzulint, több szerző pedig leírta az emberi leukocita interferon és leukocita interferon aktivitással rendelkező fehérjék DNS-kódolását (Nagata és munkatársai, Nature, 284, 316-320 /1980/; Mantei és munkatársai, Gene, 10, 1-10 /1980/; Taniguchi és munkatársai, Nature, 285, 547- 54 S /1980/). A DNS-rekombinációs eljárások középpontjában a plazmid áll, amely a baktériumokban és más mikrobákban található DNS kettős spirál nem-kromoszóma része. A plazmidban kódolt információra van szükség a plazmid újabb sejtekben történő reprodukálásához (azaz .replikon" létrehozásához), és általában egy vagy több olyan kiválasztási jellemzőnek, például baktériumok esetén az antibiotikumokkal szembeni ellenállóképességnek az átadásához, amely biztosítja, hogy a szobanforgó plazmidot tartalmazó .gazda' sejt kiónjai felismerésük után előnyben részesítve növekedjenek a szelektív táptalajon. A bakteriális plazmidok hasznosíthatósága azon alapul, hogy specifikus módon hasíthatok egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal (vagy restrikciós enzimmel). Az egyes restrikciós enzimek a plazmid ban lévő DNS különböző helyeire .emlékeznek". A hasítás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
