196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
4 196456 5 titest-termelö hibridek olyannyira hasonlítottak a mielómasejtekre, hogy tenyészetben folytonosan nőttek, és tumorokat képeztek, ha szingenetikus egerekbe implantálták őket. Nagy gyakorlati jelentőségű volt továbbá, hogy a hibridsejtek, mint a mielómasejtek, folyékony nitrogénben tárolhatók, és hosszú időtartamon keresztül életképesen konzerválhatok voltak. A hibridoma-előéllítás technikája. Egereket immunizálunk antigénnel, mint a szokásos antiszérum-elóéllításnél, rendszerint ismételt többhetes behatásokkal. Közvetlenül a fúzió előtt leöljük az egeret, és lépét aszeptikus körülmények között eltávolítjuk. A lépzacskót felvágjuk, és a léppulpát óvatosan kinyomjuk. A léplimfocitákat (körülbelül 10s sejt) sejttenyészet-táptalajban szuszpendáljuk, és mielómasejtekke) 1 : 1 - 10 : 1 arányban elegyítjük. A sejtkeveréket centrifugálással szilárdan egy csövecske fenekére ülepítjük, és a folyékony felülúszó eltávolítása után a fúzionáló közeggel (30-50%-os polietilén-glikol oldat vagy szuszpendólt, inaktivált Sendai-virus) kezeljük. E fúzionáló közeg kimosása után a sejtkeveréket körülbelül 106 sejt/ml sejtsűrűségben steril tenyésztő edényekbe (csepplapok) visszük át, és szén-dioxiddal elárasztott inkubátorban tenyésztjük. A fúzió után 2-4 héttel a hibridoma-klónok növekedése mikroszkóposán látható. Ettől az időponttól kezdve vizsgálható a tenyészet-felülúszó a keresett specifitású antitestek jelenlétére. Ehhez olyan analitikai eljárások szükségesek, amelyek antitesteket szub-mikrogramm-tartományban képesek kimutatni (RIA, ELISA, immunfluoreszcencia). A pozitív résztenyészetekből származó sejteket utána klónozzuk, azaz egysejt-kultúrákat készítünk. Az izolált kiónokat, amelyek a .helyes" antitestet termelik, szélesztjük, és tumorindikéció céljából Pristan-elókezeit szingenetikus egerek [/rendszerint Balb/c beltenyésztett egerek] hasüregébe fecskendezzük. A beoltás után 6-20 nappal a tumor megjelenésekor nyerhetők homogén antitestek a vérből vagy előnyösen a hasüregből (ascites) (egerenként 50-150 mg monoklonális antitest kitermeléssel). A fúzió után hibridekből és fúzionálatlan sejtekből álló nagyon heterogén elegy van jelen. 108 egér-lépsejt hozzáadásakor legfeljebb 103 életképes hibridoma-sejtte) számolhatunk. Mivel a hibridsejlek bizonyos kifutási időt igényelnek, mielőtt szaporodni kezdenek, a fuzionált mielómasejtek azonbar azonnal továbbnőnek, egy szelekciós eljárással kell a kevés hibridoma túlélését biztosítani. A standard-szelekciós eljárás a hibridoma-technikában az úgynevezett HAT-szelekciós táptalajon alapul. [Littlefield, J. W.: Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science 145, 709-710 (1964)]. Az .A" amino-pterin, egy fólsav-antagonista helyett áll, amely a DNS-szintézis fő útját blokkolja. Normális sejtek az amino-pterin blokkot timidin-kináz (TK) és hipoxantin-guanin-foszforilbozil-transzferáz (HGPRT) segítségével megkerülik, amennyiben a táptalajban timidint (T) és hipoxantint (H) kapnak. Amennyiben egy sejtből a két enzim valamelyike hiányzik, úgy az HAT-táptalajban nem életképes. A hibridoma-kifejlesztés céljára ezért mielómasejtek olyan mutánsait alkalmazzák, amelyek TK- vagy HGPRT-hiányosak. Ezek a sejtek HAT-táptalajban csak akkor életképesek, ha normális sejttel fúzionélnak, amely génkészletével a hiányzó enzimet a hibridsejtbe magával behozza. A lép fúzionálatlan limfocitáinak a tenyészetben természetesen korlátozott élettartamuk van, és ezért nem jelentenek semmilyen veszélyt a hibridomára. A hibridoma-előéllításakor a kővetkező problémák lépnek fel: 1. HAT-téptalaj szelekció. A fúzionálatlan mielómasejtek növekedésének szelektív visszaszorítása, amint fentebb megállapítottuk, lényeges előfeltétel hibridoma-klónok előállításához. A HAT-szelekció azonban normális, nem-deficiens sejtekre is rendkívül fiziológiétlan eljárás, amely a sejtek osztódó- és túlélőképességét befolyásolja. Különösen emberi limfociték esetében rendkívül, nehéz a HAT-táptalaj komponenseit koncentráció szerint úgy beállítani, hogy a HGPRT-negatív sejtek biztosan elpusztuljanak, a HGPRT-pozitív sejtek ellenben túlélhessék. Az egyrészt a bevetett limfociták és mielóma-sejtek száma és másrészt a többszöröződésre képes hibridek kitermelése közötti aránytalanságot a következő számok szemléltetik: Egy tipikus fúzió-menetben 108 egér-limfocita hozzáadásakor 500 hihridóma-klón általában nagyon jó eredményt jelent. Mivel egy egér lépében - ha ismételten (hiper)immunizálják is - csak 104 - 103 sejt képez antitestet az immunogén ellen [ahogy Jerne-lemeztechnikával - Jerne, N. V. and Nordin, A. A.: Science 140, 405 (1963) - kimutatták], tisztán véletlenszerű hibridoma-képzés esetén 103 - 104 kiónt kell felnevelni ahhoz, hogy csak egyetlen kívánt antitest-specifitású kiónt is várhassunk. Emberi hibridoma előállításánál az aránytalanság még kirívóbb. Jó eredménynek számít, ha fúziónként 4-10 hibrid-klónt kapunk. 2. Kromoszóma-elvesztések. Sikeres fúzió után az újonnan keletkezett hibridsejtnek körülbelül a természettől eredetileg biztosított kromoszómamennyiség kétszeresével kell rendelkeznie. Ahogy a gyakorlati tapasztalat mutatja, a hibridsejtek hajlamosak arra, hogy kromoszómákat .elveszítsenek'. Mindegyenes sejtosztódásnál fennáll a veszély a kromoszómák fiziológiótlan feleslegére, hogy ezek nem egyenlően 5 13 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
