196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
6 196456 7 oszlanak meg a két leánysejt között. Az a leánysejt, amely a feleslegből kevesebbet kap, és ezért luxus-termelésekkel nem lesz feltartva, a többivel szemben szelekciós előnybe kerül, és domináló sejt lesz a tenyészetben. Immunglobulin szintézise azonban egy hibridsejt életképessége szempontjából nem eszszenciális, hanem .luxus'-szintézisteljesítményt jelent. A nem-termelő variánsoknak egy hibridoma-klónban való megjelenése ezért gyakori eset, és költséges reklónozési intézkedéseket igényel, hogy egy klón termelőképességét biztosítani tudjuk. A kromoszómák elvesztésére való hajlandóság különösen kirívóan fajok közötti hibrideknél van meg. 3. Hibrid immunglobulinok. A míelóma-sejtek rosszindulatú B-sejtek, és önmaguktól (ismeretlen antigénkötő-fajlagosságú) immunglobulinokat képeznek. Ezt a képességet a mielóma-sejt, mint a normális B-sejt, magával viszi a hibridóméba. Mivel az Ig-molekula különböző láncai külön szintetizélódnak, és csak ezt követően állnak össze komplett antitestekké, egy hibridóma-sejtben, amelyben a két különböző L- és H-lánc szintetizálódik, véletlenszerűen 10 különböző kombináció keletkezik, amelyek közül a keresett .helyes' antitest csak az őssz-Ig-menynyiség 1/16-ét teszi ki. Ezért fejlesztettek ki nagy ráfordítással mér olyan egér-mielóma sejtmutánsokat, amelyek maguk H- vagy L-láncot nem képeznek. Emberi limfociták fúziójára azonban eddig még nem áll rendelkezésre hasonlóan kifejlesztett mielóma-vonal. Még mélyenfekvőbb problémák fordulnak elő a hibridoma-technika alternatívái esetében: 1. B-limfociták immortalizálása vírusokkal. Normális donorok emberi B-limfocitái Epstein-Barr-virussal (EBV) való fertőződéssel rosszindulatúan transzformálódhatnak. Az EBV-fertőzött, limfoblasztoid sejtek in vitro folytonosan tenyészthetők és klónozhatok. Hibridoméval összehasonlítva EBV-limfoblasztoid vonalak azonban csak 1/10 vagy kevesebb immunglobulint termelnek nem kielégítő termelési stabilitással. Feltételezik, hogy a B-sejtek korai differenciálódási stádiumban EBV-vel fixálódnak, és ezért aránytalanul gyakran kapunk olyan kiónokat, amelyek IgM-t csak nagyon csekély mennyiségben termelnek. Analóg módon transzformálhatok az Abelson-egér-leukémia vírussal (MuLV) egér B-limfociták. A limfociták itt is kedvezőtlenül egy korai differenciálódási stádiumban fixálódnak, és rossz antitest termelők. 2. Nem-transzformált B-limfociták tartós tenyészetei. Új közlemények iSpredni, B. és mtsai.: Long-term culture and cloning of nontransformed humun B-lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 1500-1516 (1981); Howard, M. és mtsai: Long-therm culture of normal mouse B-lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA in press] rámutatnak arra a lehetőségre, hogy B-limfocitákat transzformálás nélkül speciális tenyésztési feltételekkel (permanens mitogén stimulálás; limfokin-kondicionált táptalajok, stb.) permanensen tenyésszenek és klónozzanak. Monoklonális antitestek rutinszerű előállításéra ez az eljárás jelenleg biztonsággal még nem alkalmas. A technika állása ezért összefoglalva a kővetkezőképp irható le: Normális donorok B-limfocitái mesterségesen .immortalizélhatók'. A hibridoma-technika élő, tenyészetben korlátlanul sokszorozódó képes nsielóma-sejteket alkalmaz, amelyeket antigén-stimulált B-limfocitákkal fúzionálnak. A sejt - sejt-fúzióval nyert hibridsejteket HAT-szelekcióval izolálják, és egysejt-tenyészetek készítésével klónozzák. Azokat a hibridoma-klónokat, amelyek a keresett fajlagosságú antitesteket képzik, szaporítják tovább monoklonális antitestek tömegtenyésztésére. Jelentékeny hátrányok adódnak azonban a HAT-szelekcióból, kromoszóma-veszteség és hibrid immunglobulinok miatt. Egy másik eljárásban B-limfocitákat speciális vírusokkal való fertőzéssel rosszindulatúan transzformáinak, és permanensen növekvő sejtekké alakítanak át az antitest-szintézis megtartása közben. Ezek azonban notóriusan gyenge antitest-termelők. Definiált antigén-kötóspecifitású monoklonélis antitestek tömegtermelésére való tekintettel ezért a hibridoma-technika ezidejüleg az alternativ eljárásnak egyértelműen fölé van rendelve. Viszont a hibridoma-technikának is vannak nyomatékos hátrányai. A legfontosabb hátránya az, hogy az eljárás egyrészt HAT-szenzitiv fúzióspartnerre, másrészt kevés sejtfajtára, nevezetesen limfocitákra és idegsejtekre korlátozódik. A találmány ezért azt tűzte ki feladatául, hogy ezeket a hátrányokat kiküszöbölje, és egy új előnyös eljárást biztosítson permanensen tenyészthető állati és humán setjvonalak előállítására. Ezt a feladatot a találmány szerint permanensen tenyészthető állati vagy humán sejtvonalak normál állati vagy humán sejtek komponenseivel végzett fúziójával való előállítási eljárásával oldjuk meg, amit az jellemez, hogy a normál állati és humán sejteket transzformált sejtek egyedül már nem szaporodóképes sejtfragmenseivel fúzionáljuk, és szelekciós anyagok nélkül tenyésztáptalajban tenyésztjük. Lényeges a találmány szerinti eljárásnál az, hogy a fúzióhoz felhasznált fragmensek teljesen mentesek még sokszorozódásra képes sejtekLól, és maguk egyedül szintén nem szí,porod hatnak. Meglepő módon a találmány szerinti eljárás során az el nem fajzott partner, tehát a normális sejt citplazmazrészének túlsúly nem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
