196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
16 196456 17 nak és választanak ki egér-immunglobulint. Az Ag 8.653 cítoplazma-részletének hiánya eszerint nem befolyásolta a karioplaSzt-lépsejt-hibridek termelő- és kivalasztóképességét. c) Citoplasztok lépsejtekkel való fúziójából szintén olyan sejtklónok keletkeznek, amelyek in vitro szaporodtak és antitesteket választottak ki. Erre a különösen meglepő jelenségre kielégítő magyarázat jelenleg nem adható. 2. példa. Sejtfragmentálás glicerin-lizissel és fúzió humán vérlimfocitákkal. Anyagok Earle-féle egyensúlyi sóoldat (EBSS), RPMI 1640 táptalaj, borjú magzatszérum (FKS) (Boehringer Mannheim). 8-Aza-guanin a Serva (Heidelberg) cégtől, Agár (Bacto-Agar 1614) a Difco-tól (Hedinger KG cég, Stuttgart). A HS SULTAN ATCC CRL-1484 humán plazmacitoma-vonalat fagyasztással tartósított sejtanyagként az ATCC-előirat szerint felolvasztottuk, és a tenyésztésbe vettük. A Proc. Na ti. Acad. Sei. USA. 71, 2679- -2683 (1974)-ben leírt eljárás szerint 8 x 107 HS Sultan-sejtet 100 ml RPMI 1640 teljes táptalajban, amely 20 rimól 8-Ag-t tartalmaz, 48 óra hosszáig tenyésztünk. A túlélő sejteket 10 ml RPMI 1640 teljes táptalajban szuszpendáljuk, amely 8-Ag-t nem tartalmaz, és 10 napon keresztül szaporítjuk. A sejteket utána lágy-agar-Iemezeken [Coffino, P. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 68, 219- -223 (1971)], amelyeket RPMI 1640 teljes táptalajjal és 20 pmól 8-Ag-nal készítettünk, szélesztjük (körülbelül 500 sejt Petricsészénként), és szén-dioxid inkubátorban tenyésztjük. A kinövő telepeket 9 nap múlva az agar felületéről sterilen eltávolítjuk, és RPMI 1640 teljes táptalajban, amely 8-Ag-t tartalmaz, szaporítjuk. Egy (HS-SULTAN-8-AG-Rl-ként megjelölt) kiónt, amely körülbelül 20 óra duplázódási idővel nőtt, használunk a következő kísérlethez. A HS-Rl-sejtek HAT-szenzítivek voltak. A sejtek, amelyeket 1-5 x x lOVml HAT-táptalaj (RPMI 1640 teljes táptalaj 0,1 mmól hipoxatinnal, 400 nmól amino-pterinnel, 31 jumól timidinnel) sűrűségben tenyésztettük, nem szaporodtak, és 7 napon belül teljesen kipusztultak. Humán limfociták (perifériás vérből: PBL): 300 ml vénás vért gyűjtünk sterilen heparin-oldatba (2 egység/ml), és a mononukleáris sejtek frakcióját (MNC: limfociták, monociták) standard módszerekkel izoláljuk. 3 x x 108 MNC-t 100 ml RPMI 1640 + 10% FKS-ben szuszpendálunk, és a monociták leválasztása céljából tenyészedén.vekben 37 °C'-on 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 24 óra hosszáig irikubáljuk. Módszerek. HS-R1 fragnientálása: A sejteket Jett, M. és mtsai. szerint [Isolation and characterization of plasma membranes and intact nuclei from lymphoid cells. J. Biol. Chem. 252 2134-2142 (1977)] glicerinnel kezeljük, és 10 mmólos tris-sósav pufferban inkubélva lizist hajtunk végre. A magokat 200 g-nél centrifugálva (10 perc, 4 °C) elválasztjuk a membránhártyáktól, amelyek maguk centrifugálással 5000 g-nél (40 perc, 4 °C) ülepednek. Fúzió: Körülbelül 1 x 108 H2-Ri magot szuszpendálunk humán-limfocitákkal X : 1 arányban RPMI 1640-ben, és az 1. példa B.2 pontjában leírtak szerint PEG segítségével fúziónál juk. A körülbelül 1 x 10s HS-R1 sejtből nyert membrán-hártya-üledékre 1 x 107 humán-limfocita szuszpenzióját rétegezzük, és PEG segítségével fúzionáljuk. Egy kontrollrészletben körülbelül 2 x x 107 HS-R1 magot (HAT-nélküli) RPMI 1640 teljes táptalajban szuszpendálunk, és 4 darab 24-es Costar-féle csepplemezen szén-dioxid inkubátorban tenyésztjük. Az összes fúzionátumot és a kontroll-tenyészetet az 1. példában leírtak szerint egér-hasüreg-makrofágokon, mint falósejteken tenyésztjük. Humán-Ig kimutatása Lenyészet-felülúszókban: Az 1. példa B.2 pontjában leírt mikrotiter ELlSA-teszt. Rétegzésre júhból származó immunadszorptive tisztított antihumán-Ig-t használtunk. Ugyanilyen AT-készitményt használtunk az anti-humén-Ig-POD-konjugátum előállítására. A júh-AT az öszszes emberi Ig-osztállyal reagált, és nem mutatott keresztreakciót borjú- vagy égéi—Ig-vel. Eredmények: Fragmentálás glicerin-trisz-hidroklorid lizissel: A kezelés HS-Rl-sejteket magnélküli frakcióra bontotta, amely 200 g-nél ülepedett, és magnélküli citoplazma-membrán-hólyag frakcióra, amely 5000 g-nél volt ülepíthető. A mikroszkóp alatt a két frakció egyikében sem voltak intakt HS-Rl-sejtek felismerhetők. A magok több vagy kevesebb szabálytalanul határolt citoplazma-cafattal vannak körülvéve. A számlálás 85%-os mag-kitermelést adott. A hólyag-frakció kevés törmelék mellett tömegesen tartalmaz 0,5-2 um nagyságú hólyagokat felismerhető mag-alkotórészek nélkül. 2 x 107 mag tenyészete RPMI-teljes táptalajban (HAT nélkül) 12 hetes megfigyelési időtartam alatt nem mutatta HS-Rl-sejtek növekedését. A fúzionátuniok tenyészete: A mag-liml'ocita- és citoplazma-hólyag-limfocita-fúzionátumokat 96 illetve 1024-es Costar-féle csepptenyészet-Lálcára osztottuk szét, és felét HAT-adalék nélküli, felét HAT-adalékot tartalmazó RPMI teljes táptalajban egér-makrofágokon tenyésztjük. A fúzió utáni második P 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
