196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására

14

196455

15

A példákban használt rövidítések

E-Z-lizin:

E-amino-csoportján benzil-oxi-karbonil (-Z) csoporthoz kötött lizin

G-N02-arginin:

guanidin-csoportján (-NO2) csoporthoz kötött arginin

imBzl-hisztidin:

imidazolil (im) csoportján benzil (-Bzl) csoporthoz kötött hisztidin

O-Bzl-szerin:

hidroxil (-0) csoportján benzil (-Bzl) csoporthoz kötött szerin

Boc-valin:

oC-amino-csoportján tere. butoxi-karbonil (-Boc) csoporthoz kötött valin

OBzl:

orto-metil-benzil csoport, amely az oldalláncot védő csoportok egyike

VSV:

hólyagos szájgyulladés (vesicularis stomatitis) vírusa

dA:

dezoxiadenozin

dC:

dezoxieitidin

dG:

dezoxiguanozin

dT:

dezoxiribozil- timin

dbzA:

dezoxibenzil-guanozin

dibG:

dezoxiizobutil-guanozin

(DmTr)A:

5’-dimetoxi-tritiladenozin

(DmTr)T:

5'-dimetoxi-tritil timidin

TNE:

50 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 100 mmól/1 NaCl-t és 5 mmól/1 etiléndiamintetraecetsavat tartalmazó vizes oldat

AMV:

madár mieloblasztózis vírus

dGTP:

dezoxiguanozin trifoszfát

dAMP:

dezoxiadenozin monofoszfát

BSA:

bovin szérumalbumin

SEA:

Staphylococcus enterotoxin A, amely a mitogének egyike

2xSSC:

0,3 mól/1 NaCl-t és 0,03 mól/1 nátrium-citrátot (pH 7) tartalmazó vizes oldat

4xSSC:

0,6 mól/1 NaCl-t és 0,06 mól/1 nátrium-citrátot tartalmazó vizes oldat

EDTA:

etilén-diamin tetraecetsav

SDS:

nátrium-dodecil szulfát

DTT:

ditiotreitol (Cleland reagens)

1. példa

1. lépés. A gyanta mosása

150 g gyantát [Bio-Bead S-X2 (a 2% divinilbenzol kereszkötésekkel ellátott sztirol-polimer gyártmányneve, a Bio-Rad Laboratories, Egyesült Államok, gyártmánya), 200-400 mesh] adunk 1 liter desztillált benzolhoz keverés közben. 30 perccel később a gyantát üvegszűrővel kiszűrjük és megszáritjuk. Ezután a gyantát keverés közben 1 liter metanolhoz adjuk, és 30 perccel később szűréssel különítjük el. A gyantát tovább mossuk egymás után metanollal, metanol/víz eleggyel és vízzel. A mosott gyantához 1 liter 1 n vizes nátrium-hidroxid oldatot adunk. A keveréket egy óra hosszat vízfürdőn keverjük a forrásban levő viz hőmérsékletén, majd szűrjük a gyanta kinyerése érdekében. Az igy nyert gyantát vízzel mossuk. Ezt kővetően a gyantát 1 liter 1 n vizes sósavoldathoz adjuk. A keveréket egy óra hosszat keverjük vízfürdón a forrásban levő viz hőmérsékletén, majd szűrjük a gyanta kinyerése érdekében. Az így nyert gyantát vízzel mossuk. A mosott gyantát 4 liter desztillált vízben szuszpendáljuk. Az igy nyert szuszpenziót 30 percig állni hagyjuk, majd dekantáljuk a lebegő gyanta-törmelék eltávolítása érdekében. A gyantát csapadék formájában kapjuk. A gyanta-csapadékot üvegszűrön szűrjük és metanollal mossuk. A mosott gyantát kis mennyiségű dimetil-formamidhoz (DMF) adjuk. A keveréket 30 percig keverjük 80 °C-on és a gyantát szűréssel különítjük el, majd DMF-fel és metanollal mossuk. A gyantát 1 óra hosszat 2 liter metanolban keverjük és szűréssel elkülönítjük. Az így nyert gyantát levegőn szárítjuk, majd a szárítást vákuumban, 100 °C hőmérsékleten 2 órás szárítással fejezzük be.

2. lépés. Klórmetil-gyanta készítése

25 g 1. lépés szerint nyert gyantát és 100 ml desztillált klórmetil-metil-étert helyezünk egy 1 literes, háromnyakú lombikba és lassan keverjük 25 °C hőmérsékleten 1 órán át úgy, hogy a gyanta megduzzad, majd 0 °C-ra hűtjük. Keverés közben 50 ml, 1,88 ml ón-tetrakloridot tartalmazó klórmetil-metil-éter oldatot adunk fokozatosan a megduzzadt gyantához 30 perc alatt 0 °C hőmérsékleten, és további 30 percen át keverjük a reakciótermék kialakítása érdekében. Az igy nyert terméket üvegszűrön szűréssel elkülönítjük és finoman mossuk 500 ml dioxán-viz (1 : 1) eleggyel, majd 500 ml díoxán 3 n vizes sósavoldat (3:1) eleggyel. Ezután a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

9