196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
14 196454 15 YCRp3 plazmid másolatszáma eléri a közel 100 sejtenkénti értéket. Emellett a plazmid igen stabil volt (több mint 90%) ahogy ezt a leu* telepek száméból megállapítottuk. A centroméra által szabályozott funkciójú plazmidok előállításának, mint ahogy ezt az YCRp plazmidoknál bemutattuk, igen nagy haszna van úgy a heterológ DSN-ek sokszorosítása, mint a heterológ proteineknek élesztőben való kifejeződése szempontjából. Ha például egy találmány szerinti sokmásolatú élesztő vektorba megfelelő módon egy heterológ DSN-t vezetünk be, akkor a találmány szerinti eljárás segítségével - a szabályozható promotert befolyásoló faktorok változtatásával, például az ADH2 promoter esetében a szénforrás változtatásával - a heterológ DNS a vektorral együtt szaporodik a kívánt koncentrációig. Még nagyobb haszonnal járnak a találmány szerinti vektorok, amikor heterológ proteinek kifejeződéséhez megfelelő expreszsziós rendszerrel rendelkező heterológ DSN-t építünk be a vektorba, pontos orientációval. Egy fermentációs folyamat hatékonysága döntően a kifejezett protein fajtájából függ. Amikor például egy olyan protein fejeződik ki, amely a gazdaszervezetre nézve egy bizonyos koncentráción felül toxikus, úgy az egész fermentációs folyamat hatástalanná válhat, ha a protein mennyiségét közvetlenül vagy közvetve nem tudjuk szabályozni. A találmány szerinti vektorok segítségével képesek vagyunk arra, hogy az expreszsziós plazmidok másolatszámét kizárólag a szabályozható promotert befolyásoló faktorok 5 változtatásával - például a szénforrás változtatásával - alacsony, közepes vagy magas értékre állítsuk be és a mindenkor adott szinten stabilizáljuk. E vektorok révén még az is lehetséges, hogy a gazdaszervezetre 10 nézve toxikus anyagot termeljünk. Ekkor az expressziós vektorok másolatszámát egy fermentációs menet alatt több generáción keresztül alacsonyan tartjuk az egyes plazmidok stabilitásának megtartása mellett. Amikor 15 már elég sejtanyag képződött, a promotert .átkapcsoljuk', például a szénforrás megváltoztatásával, s így az expressziós plazmidok másolatszáma drasztikusan megnő. Ezzel egyidőben a kívánt protein sokszoros koneent- 20 rációban termelődik; a protein toxicitása ebben az időpontban már nem számít. A találmány szerinti vektorok révén - meglepő módon - lehetővé válik, hogy nem szelektiv tenyésztési körülményeket válasz- 25 szunk meg; ez jelentékeny előny, mindenek előtt arra való tekintettel, amikor proteinek géntechnológiai úton való előállításánál használjuk fel a vektorokat. A .Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)' intézménynél (D-3400 Göttingen, Griesbachstrasse 8, NSZK) 1984. december 28-án a következő törzseket és plazinidokat helyeztük letétbe: 2. táblázat Példa Törzs Plazmid Szénforrás a A plazmid stabilitása Másolattáptalajon %-ban a) száma) b) c) LEU* TRP* 1. SHU 32* PJDB207 glükóz 72 — 100 2. SHU 32 YCRp3 glükóz nem nő 85 1-2 3. SHU 32 YCRp3 etanol etanol-65 85 c) 4. SHU 32 YCRp3-glükózd> 98 99 100 a) A plazmid stabilitását, mint leírtuk, százalékban fejezzük ki, amit a nem szelektív körülmények közti tenyésztés esetén 25 generáció után állapítottunk meg. b) A másolatszám meghatározása a szelekció táptalajon való tenyésztésénél 12 generáció után történt. c) Nem volt meghatározva. d) A törzset úgy tenyésztettük ki, ahogy b)-nél leírtuk, de etanolos táptalajban 50 generáción át tenyésztettünk. a) E. coli RR1 törzs (vonatkozási jel: RR1); letéti szám: DSM 3178, b) Saccharomyces cerevisiae SHü 32 törzs (vonatkozási jel: SHU 32); letéti szám: gQ DSM 3182, c) pBC3Ti plazmid E. coli RRl-ben (vonatkozási jel: pBC3Tl); letéti szám: DSM 3180, d) pADH2Bs plazmid E. coli RRl-ben (vonatkozási jel: pADH2Bs); letéti szám: DSM 3179 és e) pJDB207 plazmid E. coli RRl-ben (vonatkozási jel: pJDB207); letéti szám: DSM 3181. 9
