196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
16 196454 17 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás rekombináns, stabil sokmásolatú élesztő vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy élesztő centromérát tartalmazó vektorba a stabilizáló funkció irányítására alkohol-dehidrogenéz II promotort, valamint kívánt esetben egy sokszorozó rendszert építünk be. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy élesztő centroméra 3-at tartalmazó vektort alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti vektorba egy sokszorozó rendszert építünk be. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy sokszorozó rendszerként a 2 /u-circle plazmid sokszorozó rendszerét építjük be. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy sokszorozó rendszerként a pJDB207 plazmidból származó sokszorozó rendszert építjük be. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy élesztő centroméraként a pBC3Tl plazmidból származó centroméra 3-at alkalmazzuk. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az ADH2 szabályozható promotorként a pADH2BS plazmidból származó ADH2 promotort építjük be. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás rekombináns, stabil sokmásolatú YCRp2 élesztő vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a) A pBC3Tl plazmidot BamHI-vel hasítjuk, a kapott lineáris DNS-t tisztítjuk és dcfoszforiláljuk, b) a pADH2BS plazmidot EeoRV-vel hasítjuk, a kapott lineáris DNS-t tisztítjuk, egy foszforilált BglII-linkerrel összekapcsoljuk, az igy kapott fragmentumot BamHI-vel és BglII-vel hasítjuk, ezután tisztítjuk és c) Az a) és b) pont alatti eljárással kapott fragmentumokat DNS ligázzal összekötjük. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás rekombináns, stabil sokmásolatú YCRp3 és YCRp4 élesztő vektorok előállítására azzal jellemezve, hogy a) Az YCRp2 plazmidot BglII-vel és BamHI-vel hasítjuk és a kapott 4,2 kb hoszszú fragmentumot tisztítjuk, b) a pJDB207 plazmidot BamHI-vel hasítjuk, a kapott lineáris DNS-t tisztítjuk, defoszforiláljuk és c) az a) és b) pont alatti eljárással kapott fj-agmentumokat DNS ligézzai összekapcsoljuk. 10. Eljárás élesztósejtekben olyan heterológ DNS szaporítására, amely a kívánt heterológ proteint kódolja, azzal jellemezve, hogy a) a kívánt heterológ proteint kódoló heterológ DNS-t alkalmas eljárással beépítjük az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektorba, b) a vektorral egy olyan megfelelő élesztő gazdasejtet transzformálunk, amely a 2 íj cirkuláris plazmid .vad" típusú másolatait tartalmazza, c) a gazdasejtet először egyedüli szénforrásként glükózt tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amely a szabályozható promotort dezaktiválja, d) ezután a gazdasejtet egyedüli szénforrásként etanolt tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amely a szabályozható promotort reaktiválja, e) majd kivánt esetben a gazdasejtet újból a promotort dezaktivéló, egyedüli szénforrásként glükózt tartalmazó táptalajba visszük vissza és itt tenyésztjük, f) a vektorokat a sejtekből a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk és g) a heterológ DNS-t a vektorokból a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk. 11. Eljárás élesztósejtekben heterológ protein kifejezésére azzal jellemezve, hogy a) a kívánt proteint kódoló heterológ DNS-t expressziós rendszerével együtt megfelelő irányítottsággal beépítjük az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektorba, b) a vektorral olyan élesztő gazdasejtet transzformálunk, amely a 2 m cirkuláris plazmid .vad" típusú másolatait tartalmazza, c) a gazdasejtet előbb egyedüli szénforrásként glükózt tartalmazó táptalajon tenyésztjük, amely a szabályozható promotort dezaktiválja, d) ezután a gazdasejtet egyedüli szénforrásként etanolt tartalmazó táptalajon tenyésztjük, amely a szabályozható promotort reaktiválja, e) ezután a gazdasejtet újból a szabályozható promotort dezaktivéló, egyedüli szénforrásként glükózt tartalmazó ' táptalajba visszük át és itt tenyésztjük, f) majd a kivánt proteint a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk. 12. Eljárás az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektor szaporítására azzal jellemezve, hogy a) az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított vektorral olyan megfelelő élesztő gazdasejtet transzformálunk, amely a 2 m cirkuláris plazmid .vad" tipusú másolatait tartalmazza, b) a gazdasejtet először egyedüli szénforrásként glükózt tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amely a szabályozható promotort dezaktiválja, c) ezután a gazdasejtet egyedüli szénforrásként etanolt tartalmazó táptalajban tenyésztjük, amely a szabályozható promotort reaktivélja, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
