196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
4 196454 5 fragmentumokat adunk hozzájuk, amelyekről feltételezzük, hogy egy centroméra (CEN) funkcionális elemeit hordozzák [L. Clarke és J. Carbon, Nature, 287, 504-509 (1980); D. T. Strinchcom és munkatársai, J. Mól. Bioi., 158, 157-179 (1982)]. Ezek az YCp-nek (yeast centromere plasmids) nevezett plazmidok a szelektív feltételek mellett tenyésztett sejtek 80%-ában, sejtenként 1-2 másolatszámmal vannak jelen (lásd: L. Clarke és J. Carbon, valamint D. T. Stinchcomb és munkatársai fenti közleményeit). A Saccharomyces cerevisiae élesztő sejt egy endogén DNS plazmidot tartalmaz, neve: .2 p-Circle". Ez a plazmid mitózis szempontjából stabil és sejtenként 20-50 másolattal van jelen [J. R. Broach: Life Cycle and Inheritance, a .Molecular Biology of Yeast Saccharomyces" kiadványban; szerkesztők: J. Strathern, E. Jones és J. R. Broach, kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1981); 445-470 oldal]. A 2 p cirkuláris plazmidnak saját amplifikációs rendszere van, amely lehetővé teszi, hogy a plazmid sejt-ciklusonként többszőr replikálódjék [M. Jayaram és munkatársai, Cell, 34, 95-104 (1983); Y. Kikuchi, Cell, 35, 487-493 (1983)]. Több különböző élesztő vektort állítottak elő a 2 p plazmidot használva alapként; legtöbbjük nem szelektív táptalajban, sejtenként 20- -50 másolatszám mellett 60-80%-ig mitótikusan stabil (lásd: M. Jayaram és munkatársai, valamint Y. Kikuchi fent idézett közleményét, valamint: J. Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978), ezek tehát részben elvesztették a 2 p stabilitásét. Ez a találmány azon a felismerésen alapszik, hogy az élesztő-centroméra-funkció (CEN) egy szabályozható élesztő promoterrel, transzkripció révén irányítható. Bebizonyítjuk, hogy az élesztő centroméra DNS az YRp plazmidot már nem tudja mitótikusan stabilizálni, ha egy erős promoter írja át [L. Panzeri és munkatársai előadása a .Molecular Biology of Yeasf konferencián, lásd az előadások kivonatát tartalmazó kiadvány 69. oldalét (Cold Spring Harbor Laboratory, 1983)]. Jelen találmányban egy CEN szekvenciát - előnyösen a CEN3 szekvenciát - helyezünk egy szabályozható élesztő promoter, előnyösen az alkohol-dehidrogenáz-II promoter elé; igy jutunk az YCRp plazmid (yeast centromere regulated) családhoz. Az élesztő alkohol-dehidrogenáz-II gén (ADH2) expressziója glükóz jelenlétében dezaktiválódih és . nem fermentálható szénforrások jelenlétében, mint például etanol jelenlétében, reaktivélódik [T. Young és munkatársai a .Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals' kiadvány 335-361 oldalán; szerkesztők: A. Hollaender, R. D. DeMoss, S. Kaplan, J. Konisky, D- Savage és R. S. Wolfe; kiadó: Plenum Publishing Corporation (1982)]. Kimutatjuk, hogy az ADH2 gén 5’-nél lévő szekvenciái, ha ezek alkalmas módon egy másik génnel kapcsoljuk össze, glükózdezaktivéló tulajdonságot kölcsönözhetnek e génnek [D. R. Beier és T. Young, Nature, 300, 724- -728 (1982)1. Ha az ADH2 promotert tartalmazó 5'-nél lévő regulációs szekvenciáik (röviden: AUH2-promoter) elé beépítjük a CEN3 szekvenciát, akkor lehetővé kell váljék az APH2-CEN3 fúzió expressziójának az irányítása azáltal, hogy a táptalajban egyszerűen megváltoztatjuk a szénforrást. Amennyiben ADH2-CEN3 fúziós plazmiddai (YCRp) transzformált élesztő sejteket glükóz jelenlétében tenyésztünk, az ADH2 promoter dezaktiválódik (ADH2-AUS), ugyanakkor a CEN3 az YCRp plazmidot mitózis szempontjából stabilizálja (CEN3-AN). Amikor a szénforrást átállítjuk etanolra, az ADH2 promoter reaktiválódik (ADH2-AN) és expressziója révén blokkolja az egész CEN3 szakaszt (CEN3-AUS). Eredmény: az YCRp plazmidok már nem stabilak. Ebben az állapotban az YCRp plazmidokat élesztő sejtekben a kívánt másolatszámig lehet sokszorozni. Az elszaporítás után, egyszerűen átállítjuk a táptalajt etanolról glükózra és ezeket az YCRp plazmidokat a most mér újra funkcionáló CEN3 szekvenciával stabilizáljuk. A találmány nem korlátozódik a CEN3 szekvenciára, mint stabilizáló elemre és az ADH2 génre, mint szabályozható alkotó elemre; ugyanis ehhez hasonlóan más stabilizáló elemeket is használhatunk, ilyen például a CEN6 és CEN11, amennyiben ezeket megfelelő módon fuzionáljuk szigorúan szabályozható élesztő promoterekkel. Az egyes promoterektől függően, számos lehetséges faktorral lehet ezután a szabályozást elérni. Példaként említjük a következő faktorokat: a szénforrás megválasztása, hősokk, oxigén, hem, foszfát, stb. A csatolt ábrákkal közelebbről világítjuk meg a találmányt. Az 1. ábrán sematikusan ábrázoljuk a pBC3Tl és az ADH2BS plazmid restrikciós- és gén-térképét. Ezenkívül bemutatjuk az YCRp2 plazmid előállításét. A 2. ébrén sematikusan ábrázoljuk a JDB207 plazmid restrikciós- és gén-térképét. Ezenkívül bemutatjuk az YCRp3 és az YCRp4 plazmid előállítását. A 3. ábrán az YCRp plazmidok másolatszámának meghatározására végzett vizsgálat eredményét mutatjuk be. A 3. ábrához tartozó magyarázat: A DNS mintákat F.eoRl-el hasítottuk es az Ylp5 plazmid nicktranszlatált DNS-ével hibridizáltuk. 1- a SHU 32 ([pEB 108) ossz DNS-éből 3 pg -tipikus YCp plazmid 2- a SHU 32 (YCRp2) ossz DNS-éből 3 ug -tenyésztés: glükózzal 3- a SHU 32 (YCRp2) ossz DNS-éből 3 pg tenyésztés: elanolial, utána glükózzal 5 10 15 20 25 33 35 40 45 50 55 60 4
