196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
6 196-154 7 4- a SHU 32 (YCRp2) ossz DNS-éböl 3 mg -tenyésztés: etanollal (50 generáción keresztül), majd glükózzal 5- a SHU 32 (pJDB207) ossz DNS-éből 1 Mg 6- a SHU 32 (pJDB207) ossz DNS-éből 0,2 Mg 7- a SHU 32 (pJDB207) össz DNS-éből 0,05 Mg 8- a SHU 32 (YCRp3) össz DNS-éből 5 Mg -tenyésztés: glükózzal 9- a SHU 32 (YCRp3) össz DNS-éböl 1 Mg -tenyésztés: etanollal, utána glükózzal 10- a SHU 32 (YCRp3) össz DNS-éből 0,05 Mg- tenyésztés: etanollal, utána glükózzal 11- a SHU 32 (YCRp3) össz DNS-éböl 0,005 Mg- tenyésztés: etanollal, utána glükózzal Az 1. táblázat a SHU 32 élesztő törzsben lévő YCRp2 plazmid stabilitási- és másolatszám-adatait tartalmazza. A 2. táblázat a SHU 32 élesztő törzsben lévő YCRp3 plazmid stabilitási- és másolat-szám-adatait tartalmazza. A találmányban használt minden DNS, restrikciós- és anyagcsere-enzim elöállitója a New England Biolabs és a Bethesda Research Laboratories volt. Az enzimek a forgalmazók által megadott feltételek mellett és az általuk előirt pufferekben kerültek felhasználásra. Az ATP-t és a dezoxi-nukleotid-trifoszfátokat a Sigma cégtől szereztük be, a DNS-linkert a New England Biolabs-től. Az E. coli kovalens kötésű cirkuláris plazmid DNS-ének tisztítását és az E. coli transzformálását a már közölt módszerekkel végeztük el [L. Clarke és J. Carbon, Cell, 9, 91-99 (1976); S. L. Peacock és munkatársai: Bioch. Biophys. Acta, 655, 243-250 (1981)]. Az .E. coli-miniscreens' módszert Bimbóim és Doly leírása szerint alkalmaztuk H. C. Bimbóim és J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513— 1523 (1979). Az élesztő sejtek transzformálását is a már ismert módon végeztük [lásd: A. H. Hinnén és munkatársai (1978) már idézett közleményét], de a következő módosításokkal: 200 ml sejt szuszpenziót - sűrűsége 2.107 sejt/ml - tisztítunk úgy, hogy 25 ml vízzel mossuk és centrifugáljuk. A sejteket 10 ml 1 mól szorbit, 25 mmól EDTA (pH = 8) és 50 mmól ditiotreitol (DTT) tartalmú oldattal kezeljük 10 percig 30 °C-on, majd 10 ml 1 mólos szorbittal mossuk. Az ülepített sejteket ezután 10 ml SCE oldatban [1 mól szorbit, 0,1 mól nátrium-citrát (pH = 5,8), 0,01 mól EDTA] óvatosan reszuszpendáljuk és 30 °C-on 1 mg zimoliázzal (Zimolyase 5000; Kirin Brauerei) kezeljük. Amikor a szuszpenzió 100 ml-ét 0,9 ml 10%-os SDS oldathoz adjuk, 80% szferoplaszt képződés következik be; a szuszpenzió abszorpcióját 800 mm-nél mérjük; az abszorpciót 0%-nak vesszük az enzim hozzáadása előtt; a 10%-os SDS-ben végbemenő lízis az abszorpció csökkenéséhez vezet. A sejteket ezután háromszor mossuk 10 ml 1 mólos szorbittal, egyszer 1 mól szorbit, 10 mmól CaCk és 10 mmól trisz. HC1 (pH = 7,4) tartalmú oldattal, majd ugyanezen oldat 1 ml-ében reszuszpendáljuk. A tisztított plazmid DNS-éből 5-15 Mg-ot adunk 100 m1 reszuszpendált sejthez és óvatosan 15 percen ét keverjük. A szuszpenzióhoz ezután 15 percen belül óvatos keverés közben hozzáadunk 1 ml olyan oldatot, amely 20% (tömeg/térf.) polietilén-glikolt (4000; Merck), 10 mmól kalcium-kloridot és 10 mmól trisz. HCl-t (pH = 7,5) tartalmaz. A sejteket ezután léce ntrifugáljuk és 200 m1 SOS oldatban [1 mól szorbit, 33,5% (térf./térf.) YEPD-leves és 6,5 mmól kalcium-klorid] inkubáljuk 20 percig 30 °C-on. Ezután a szuszpenzió 100 pl-ét 20 ml .Bottom-agar'-t tartalmazó Petri-csészére visszük fel, s ezt azután 10 ml 50 °C-os .Top-agar "-ral fedjük. A .Bottom-agar" összetétele: 182 g szorbit, 20 g glükóz, 0,7 g YNB (élesztő-nitrogér.-bázis) és 30 dg Difcc^ agar ad 1 liter yiz. A .Top-agar" összetétele: a .Bottom-agar"-hoz 50 ml-enként 1-1 ml-t adunk a következő oldatokból: adenin oldat (1,2 g/ml), uracil oldat (2,4 g/ml), ,-trp drop-out mix" oldat. A ,-trp drop-out mix" az alábbi aminosavakat tartalmazza: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g leu, 0,4 g lys, 0,1 g met, 0,6 g phe és 0,5 g thr 100 ml vízben. A Trp* szelekciónál 103 transzformált élesztő sejtet kaptunk proug plazmid-DNS. A plazmidok stabilitását az élesztőben úgy vizsgáljuk, hogy szelektív vagy nem szelektív tenyésztés után a sejteket vízzel higítjuk és YPD (élesztö-penton-dextrán) lemezekre (nem szelektív) öntjük ki. A lemezeket 30 órán át 28 °C-on tenyésztjük, s ezután a sejteket YNB-CAA lemezekre (TRP* vagy LEU* szelektálás) visszük. A plazmid stabilitását százalékban fejezzük ki úgy, hogy a szelektíven nőtt telepek számét elosztjuk a nem szeleküv viszonyok közt nőtt telepek számával és ezt százzal szorozzuk. A plazmidok másolatszamának megállapítása Southern analízissel történik [E. Southern, J. Mól. Bioi., 98, 503-517 (1975)]. A szelektív táptalajon nőtt SHU 32 (YCRp) transzformált sejtek össz DNS-ét EcoRI restrikciós endonukleózzal emésztjük és agaróz gél elektroforézissel frakcionáljuk. A DNS-t nitrocellulóz szűrőkre visszük ót, majd nicktranszlatált jelzett YIp5 plazmid DNS-el hibrid:zéljuk (az Ylp5 egy olyan pBR322 plazmid, amely az URA3 élesztő gént tartalmazza; lásd: K. Struhl és munkatársai fent idézett közleményét). Röntgen filmre való exponálás utón legalább két sáv figyelhető meg: az egyik az egyetlen kromoszómális URA3 másolatot jelenti, a másik (a többiek) az YCRp piacmid fragmentumát (fragmentumait). Egy mérik kontroll az YCp plazmiddal transzformáit SHU 32 DNS próba-anyag volt; így közvetlen összehasonlítás vált. lehetővé az YCp és az YCRp centroméra plazmidok között. Né5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
