196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
2 196454 3 A találmány tárgya eljárás rekombináns, sokmásolatú élesztő vektorok előállítására és e vektorok szaporítására, továbbá a vektorok alkalmazása. Proteineknek megfelelő gazdaszervezetekben való géntechnológiai előállításánál azt. a heterológ DNS-t, amely a kívánt proteint kódolja, rendszerint egy alkalmas klónozó vektor kétszálú DNS-ébe építik be, amelyet ezután egy megfelelő gazdaszervezetbe kell bejuttatni. A gazdaszervezetben ezután replikációs rendszerének segítségével - az eredeti gazdasejt DNS része együtt replikálódik a beépített DNS fragmentummal. Anienynyiben a plazmid megfelelő leolvasási rendszert és promotert tartalmaz, akkor benne nemcsak a DNS replikálódik, hanem az általa meghatározott protein is kifejeződik. A protein kitermelés természetesen a gazdaszervezet replikációs rendszerének hatékonyságától függ, azonban nem utolsó sorban attól is, hogy milyen mennyiségben áll rendelkezésre a kifejezhető DNS-anyag. Sok olyan plazmid létezik, amelyekből csak egy fordul elő sejtenként; néhány plazmid sejtenként egynél több másolatban van jelen. Például a ColEl plazmidnak az E. coli kromoszómájában 10-20 másolata létezik. A ColEl-ből származtatott plazmidok protein inhibitorok hozzáadáséra szaporodnak fel, ebből kifolyólag természetesen igy nem lehet elérni a protein sokszorosodását. Bizonyos plazmidokat, az úgynevezett .runaway' plazmidokat a hőmérséklet növelésével is szaporodásra lehet bírni. A protein kitermelés azonban nemcsak a plazmid másolatszámától függ, hanem magénak a plazmidnak a stabilitásától is. Élesztő számára alkalmas vektorok közül ismerünk olyan plazmidokat, amelyek nagy másolatszámmal szaporíthatok, de instabilak; mások rendkívül stabilak, de sejtenként csak igen csekély másolatszámmal fordulnak elő. A jelen találmány egyik feladata abból áll, hogy élesztőnél alkalmazható olyan vektor rendszert állítson elő, amely megfelelő mésolatszémmal stabilan fenntartható és alkalmazható. Sok heterológ DSN tartalmú plazmidot csak szelekciós feltételek mellett lehet proteinek géntechnológiai eljárással való előállításéhoz felhasználni, mivel egyébként a nem transzformálódott mikroorganizmusok kerülnek túlsúlyba. Ezek a szelektív feltételek gyakran csak antibiotikumok alkalmazásával teremthetők meg. Amellett, hogy ezek az anyagok az előállítást is megdrágítják, az antibiotikum tartalmú fermentleveknek a sorsa is problémákat vet fel (rezisztencia veszély!). A találmány további tárgyát, képezi egy olyan sokmásolatú élesztő vektor megszerkesztése, amely stabilan tenyészthető nem szelektív körülmények közt is. Ezeket a feladatokat a találmány úgy oldja meg, hogy élesztő gazdasejt rendszereket alkalmaz és olyan élesztő expressziós vektorokból származó elemeket - ilyenek a promoterek, cenlromérék és eredeti replikációs elemek -, amelyek géntechnológiai módszerekkel - a kővetkezőkben leirtak szerint - megfelelő módon összekapcsolhatók. A szakirodalomi idézetek megvilágítják a technika mai állását és egyéb részletes leírással is szolgálnak. Heterológ gének élesztőben való expressziójára különböző típusú vektorok használhatók fel [N. Gunge, Ann. Rev. Microbiol., 37, 2532-2576 (1983)]. Az élesztő vektorok egyik osztálya az úgynevezett élesztőbe integrálódó plazmidokból (YIp) áll, ezek rendszerint bakteriális plazmidokból, mint például a pBR322-ból, az élesztő kromoszómális DNS-ének fragmentumaiból és egy szelekciós génből tevődnek össze. Ezek a vektorok igen csekély kitermeléssel transzformálják az élesztő sejtet (1-10 transzformált sejt pro 1 ug plazmid DNS). A transzformált fenotípusnál az Ylp plazmid az élesztő kromoszómájába integrálódik [A. H. Hinnen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929- -1933 (1978); K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1035-1039 (1979)]. Ismeretes, hogy élesztő DNS-ből vagy más eukarióta DNS-ből származó fragmentumok az YIp plazmidoknak olyan tulajdonságot kölcsönöznek, hogy azok extrakromoszómálisan replikálódnak [D. T. Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39-43 (1979); C. L. Hsiao és J. Carbon, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 3829-3833 (1979); C. S. M, Chan és B. K. Tye, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 6329-6333 (1980); B. D. Hyman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 1578-1582 (1982); V. A. Zakian, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 3128-3132 (1981)]. Azokat a vektorokat, amelyek ARS alkotórészt (autonomously replicating sequence) tartalmaznak, YRp (yeast replicating plasmids) vagy egyszerűen ARS-plazmidoknak nevezik. Az YRp plazmidok mitótíkus stabilitásának vizsgálata azt mutatta, hogy még szelektív növekedési feltételek mellett is csak igen kevés sejt (5-25%) tartalmaz plazmidot [lásd D. T. Stinchcomb, C. L. Hsiao, B. D. Hyman és munkatársai fent idézett közleményeit, valamint: M. Fitzgerald-Hayes és munkatársai, Cell, 29, 235-244 (1982)]. Ezeknek a plazmidoknak a másolatszáma sejtenként 20-50 nagyságrend körül mozog (lásd B. D. Hyman és munkatársai fent idézett közleményét). Az is ismeretes, hogy ha élesztő vektorban úgynevezett centroméra szekvenciák vannak jelen, akkor ezek gyakran javítják a vektor stabilitását. Azonban a centroméra funkció révén nem javul a plazmid sejtenként! másolatszáma. Az YRp plazmidok mitótikus stabilitását azáltal lehet javítani, hogy olyan élesztő DNS 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
