196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
kódoló új 1F7 klón felismerése. Ez a klón tartalmazza az IFN-oC2(Arg)-ot kódoló 4 196452 5 C CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC 153 . TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA .TTT CCC CAG GAG GAG 195 TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC 237 CAT GAG ATG ATC CAG GAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG 279 GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC 321 TA 323 képletű részszekvenciát, , amely az IFN-oC2(Arg 1-ban lévő i" Leu Ala Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser .28 Gys • Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu 42 Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr He Pro Val Leu 56 His Glu Met Ile Gin Gin He Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys 70 Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe 84 képletű részszekvenciÁt kódolja. Az új IFN-oC2(Arg) a Nature 287, 408-411 (1981) közleményben ismertetett összes interferontól a 18-84 aminosav-tartományban tér el, nevezetesen 23 és 34 helyzetű Arg-ban. A találmány szerint a következő módon járhatunk el. Namalwa sejteket Sendai vírussal ismert módon indukálunk és a megfelelő sejteket kiválasztjuk. A kiválasztott sejteket, célszerűenn 6-12 órával, előnyösen 9 órával a vírussal történő indukció után, célszerűen a maximális IFN-mRNS szintézis időpontjában, denaturáljuk. A sejtmagok leválasztása után a sejt-citoplazmából fenolos extrakció és etilalkoholos kicsapás segítségével állítjuk elő a tisztított RNS-t, amelyből ezután oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával izoláljuk a poli(A)*RNS-t, s ezt grádiens centrifugálás révén interferon specifikus szekvenciákra nézve dúsítjuk (lásd 1. ábra baloldali részét). Az így tisztított poli(A)*RNS-t használjuk templátként a reverz transzkriptáz enzim segítségével történő egyszálú cDNS előállításához. Ehhez az egyszálú DNS lánchoz a DNS-polimeráz I-el történik a komplementer második DNS szál szintetizálása. A cDNS szintézisét és a komplementer második DNS szál szintézisét az adenin, timidin, guanozin és citidin dezoxinukleozid-trifoszfátjait tartalmazó oldatban végezzük. A kapott kétszálú cDNS keveréket ezt kővetően az SÍ nukleáz enzimmel a szálak mindkét végén úgy módosítjuk, hogy a láncvégekről túllógó darabokat eltávolítjuk, majd azokat a kettósszállú DNS molekulákat izoláljuk grádiens centrifugálással, amelyek legalább 600 bázispárral rendelkeznek. Az igy kapott cDNS keverékben mindkét fonál 3’ végét 15 mukleotiddal meghosszabbítjuk oligo-dezoxicitidin hozzáadásával, terminális transzferáz enzim segítségével, s igy a rekombinóns molekulák szintézisének egyik alkotórésze már készen áll (lásd az 1. ábra baloldali részét). Második komponensként gyűrűs, kétszálú, előnyösen Escherichia coliból származó plazmidot használunk, például az Escherichia coli pBR322 plazmidját, amelyet a Pst I restrikciós endonukleázzal lineárissá alakitunk, majd a cDNS keveréknél követett eljárással analóg módon a molekula 3’ végeit oligo-dezoxiguanozin hozzákapcsolásával úgy módosítjuk, hogy kilógó oligo-dezoxiguanozin végek keletkezzenek. Ezek a végek a cDNS molekulák szabad oligo-dezoxicitidin végeivel stabil kétszálú DNS darabokat képeznek (lásd az 1. ábra jobboldali részét). Az így előállított - például a pBR322-ból és a cDNS-ből előállított - hibrid plazmiddal egy mikroorganizmust, például az Escherichia coli HB101-et, gazdasejtté transzformálunk, amelyben e DNS-nek a replikációja és kifejeződése végbemegy. Az így előállított klónolc közül telep hibridizációs módszerrel kimutatjuk azokat, 35 amelyek IFN-oC-t vagy IFN-ß-t kódoló specifikus szekvenciákat tartalmaznak. Minta-anyagként radioaktív izotóppal jelzett cDNS-t használunk, amelyet az 5’dCCTTCTGGAACTG3' interferon szekvenciákra specifikus 40 primerrel IFN-mRNS-t tartalmazó RNS-böl reverz transzkripció segítségével szintetizálunk. Itt a tridekanukleotid radioaktív jelzése a végén történik, előnyösen a ^-32P-ATP-vel és T4-polinukleotid kinázzal. A re- 45 verz transzkriptáz reakcióhoz szükséges iniciációs komplexet feleslegben adagolt jelzett tridekanukleotiddal és Sendai vírussal indukált sejtekből származó poli(A)*RNS-el állítjuk elő, az előbbiekben leirt feltételekkel 50 analóg módon (lásd a 2. ábrát). Az így előállított cDNS tehát csak akkor lesz radioaktív jelzéssel ellátva, ha a reverz transzkriptáz reakcióhoz szükséges iniciációs komplex létrejön a tridekanukleotiddal, mivel a jelzést 55 kizárólag ez a szegmentum tartalmazza. Ezáltal - a találmánynak megfelelően -, a tridekanukleotiddal komplementer DNS szekvenciával rendelkező DNS felismerésének és ezáltal az o£- és ű- interferon DNS felismerésének 60 biztosítunk nagy szelektivitást. Azckat a transzformált baktériumtele'peket, amelyek beépített tridekanukleotid komplementer DNS szekvenciával rendelkező hibrid plazmidokat tartalmaznak, autoradiográfiával tesszük lát- 65 hatóvá (lásd a 3. ábrát). Ezen a módon kö4
