196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
6 196452 7 rülbelül 13.000 transzformált baktérium klónból 190 olyan kiónt izoláltunk, amelyek a tridekanuk-leotiddal iniciált cDNS miatt pozitív szignált adtak, azaz a génbank kiónjainak körülbelül 1%-a tartalmazta a dCCTTCTGGAACTG specifikus szekvenciát. A rekonbináns DNS molekulákban az interferon specifikus nukleinsavak kimutatását RNS-transzfer-hidridizációval, hibrid izolálással, restrikciós térképezéssel és nukleinsav szekvencia analízissel végezzük. A képződött interferon-polipeptid biológiai vizsgálatát úgy végezzük, hogy meghatározzuk vírusellenes hatását és immunológiai módszerekkel meghatározzuk az interferon típusát. Az ilyen módon izolált IFN-cC2(Arg)-t kódoló gén exprsszióját baktériumokban - de más organizmusokban is, mint például élesztőben is - megvalósíthatjuk, amikoris egy promoter és egy riboszómakötó szekvencia kombinációjának beiktatásával a spontán expresszió értékének mintegy lO^szeresét érhetjük el. A következő példák hivatottak a találmány közelebbi megvilágítására. A példa Megfelelő sejtvonal kiválasztása humán IFN-oC - IFN-ß - mRNS-t tartalmazó poli(Aß RNS termelésére Különböző humán sejtvonalakat indukálunk Sendai vírussal interferon termelésre a szakirodalomból ismert eljárással, majd 24-48 óra múlva típus-specifikus antiszérumokkal történő neutralizációval meghatározzuk a sejt felülúszók IFN-cC és IFN-ß tartalmát. Néhány vizsgált sejtvonalban az IFN-oC és IFN-ß közti mennyiségi viszonyokat a fenti táblázatban közöltük. Ebből kitűnik, hogy például a Namalwa sejtek valamivel több, mint 50% IFN-oC-t és körülbelül 50% IFN-ß-t termelnek, Sendai vírussal történő indukálás után. A neutralizációs vizsgálatot a következőképpen végezzük. A Sendai vírussal indukált sejttenyészetek felülúszójából körülbelül 10 interferon egységet tartalmazó mennyiséget 60-90 percig 37 °C-on inkubálunk. 1. IFN-cC elleni antiszérummal; végső higitás 1 : 100; (következő intézménytől kaptuk: Research Resources Branch, National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Md, USA), 2. humán IFN-ß elleni antiszérummal; végső hígítás 1 : 300; (dr. Y. H. Tan-tói - University of Calgary, Kanada - kaptuk), 3. az 1. és 2. antiszérum keverékével. Inkubálás után a maradék interferon aktivitást plakkredukciós vizsgálattal határozzuk meg. [Journal of Interferon Research, 2, 575-585 (1982)]. B példa Emberi IFN-cC- és IFN-ß- mRNS-t tartalmazó poli(A)'RNS előállítása Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből A Namalwa sejtek tenyésztését és a Sendai vírussal történő indukciót a szakirodalomból ismert módszer szerint végezzük [Methods in Enzymology, 78A kötet, 69-75 old. (1981), Academic Press, New York]. A mRNS preparálásának időpontjául a Sendai vírussal történő indukció utáni 9. órát (6-12 óra) választjuk, mivel az interferon specifikus mRNS részaránya ezen időtartam után éri el maximumát. A sejteket 20 percen át 1000 g mellett lecentrifugáljuk, egyszer NP-40-pufferben (0,14 M nátrium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid, 10 mM trisz-sósav pH = 7,4) mossuk, majd 0,5% NP-40 (Shell) nem ionos detergenst és 2 mg/ml bentonit tartalmú NP-40 pufferben reszuszpendáljuk. A keveréket 5 percig tartjuk jégfürdöben, majd a sejtmagokat centrifugélással - mint fent - ülepítjük, majd az RNS tartalmú citoplazma frakcióhoz (felülúszó) 2% SDS-t, 5 mM EDTA-t és 50 mM trisz-sósavat (pH = 9,0) adtunk, s ezután az elegyet háromszor fenol-kloroform elegyével és egyszer kloroformmal extraháljuk. Ezután az RNS-t etilalkohollal kicsapjuk. A poli(A)4RNS-t a szakirodalomból ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 1408-1412 (1972)] oligo-(dT)-cellulóz kromatográfiával tisztítjuk és 10 mM nótrium-acetát puffer (pH = 5,5) és 1 mM EDTA tartalmú 5-20% szacharóz-grádiens centrifugélással (20 órán át 25000 fordulat/perc mellett, Spinco SW27 rotorral) molekula tömegük szerint elválasztjuk, majd a 6S (szedimentációs egység) és 18S (az egyszerűség kedvéért .12S-RNS'-nek neveztük) nagyságrend közti molekulákat összegyűjtjük (lásd az 1. ábra baloldalát). Az interferon specifikus mRNS (IFN-oC- és IFN-ß-mRNS) tartalmat a .12S-RNS '-nek Xenopus laevis oocitákba [J. Embryol. and Exper. Morph., 20, 401-414 (1968)] történő mikroinjekciója révén állapítjuk meg és az interferon aktivitás mértékét az oocita felülúszóban határozzuk meg. 1 Mg injiciált .12S-RNS ‘ közepes interferon titert, körülbelül 1000 nemzetközi interferon egységet (I. E.) eredményezett a 69/19 interferon standardra vonatkoztatva: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
