196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
2 196452 3 A találmány tárgya eljárás oC2(Arg)-interferon, ezt az interferont kódoló DNS-szekvencia, valamint a genetikai információt hordozó mikroorganizmusok elóállitására. A szakirodalomból három humán interferon ismeretes, ezek a következők: leukocita interferon (cC-interferon, röviditve: IFN-oC), fibroblaszt interferon (ű-interferon, rövidítve: IFN-ß) és immun interferon (^-interferon, rövidítve: IFN-y). [W. E. Stewart, II, .The Interferon System", Springer, Wien- New York, 2. kiadás (1981)]. A virussal stimulált emberi leukociták, vagy emberi mieloblasztoid sejtek termelik a leukocita interferont, virussal, vagy egy megfelelő nukleinsavval indukált emberi fibroblasztok a fibroblaszt interferont és a mitogénnel, például konkanavalinnal indukált emberi T-lirafociták az immun interferont. Ezenkívül ismert még, hogy a B limfocita típusú emberi sejtek, ilyenek például az 5 NC-37, Namalwa, Akuba vagy RPMI 1788 sejtvonalak, virussal történő stimulálás után egyidejűleg termelnek leukocita interferont és fibroblaszt interferont [Journal of General Virology, 38, 51-59 (1977)]. Ebben az esetben 10 a termelt IFN-oC és IFN-ß mennyiségi viszonyai az indukció körülményeivel befolyásolhatók [Journal of Interferon Research, 2, 575-585 (1982)]. Például a különböző sejtvonalak Sendai virussal indukált sejtjeiből a 15 következő IFN-cC és IFN-ß mennyiségek termelhetek: IFN-cC IFN-ß . IFN-cC + IFN-ß ellen termelt speciális antiszérummal neutralizált interferon aktivitás százaléka Namalwa 52 34 298 NC-37 40 52 297 Akuba 85 27 298 RPMI 1788 68 29 298 \ -------------------------Sejtvonal Továbbá a leukocita és mieloblasztoid sejt eredetű IFN-oC gének molekula klónozása [Nature, 284, 316-320 (1980)]; Science, 209, 1343-1347n (1980) és a 0.032.134 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés illetve Nature 287, 411-416 (1980), 290, 20.26 (1981); 2 079 291 számú nyilvánosságra hozott brit szabadalmi bejelentés szolgáltatta azt az eredményt, hogy az IFN-cC-t egy olyan gén család kódolja, amely legalább 10 egymástól megkülönböztethető génből áll, s ebből az következik, hogy ezen DNS szekvenciák géntermékei nem egységes proteinek, azaz az IFN-cC egymáshoz hasonló proteinek keverékéből áll. Ezeket a szubtipusokat az irodalom a kövekezóképpen jelöli: IFN-oC 1,2,3........... [Nature, 287, 401-408 (1980) és Gene, 15, 379-394 (1981)] vagy LelFN A, B, C,....... [Nature, 290, 20-26 (1981)]. Ezzel szemben azt találtuk, hogy az IFN-ß-t egységes DNS szekvencia határozza meg, s ez azt jelenti, hogy a fibroblaszt interferont egyetlen gén kódolja, igy nem is ismertek altípusok [Nature, 285, 542-547 (1980)]. Jóllehet az IFN-cC-t és IFN-ß-t kódoló gének közt nem jön létre kereszthibridizáció, csak az IFN-cC gén családon belül, szekvenciáik mintegy 45X-a homológ [Nature, 285, 547- -549 (1980)]. Itt az a leghosszabb szekvencia darab, amely a funkcionális IFN-oC génekben (a hétből ötben) és az INF-/) génben teljesen azonos, 13 nukleotid hosszúságú. Ezt az 5’-dCCTTCTGGAACTG-3’ képletű tridekanukleotidot az European Journal of Cell Biology 25, 8-9 (1981) közleményben ismertetik, és egyidejűleg javasolják, hogy ezt a szintetikus tridekanukleotidot vagy ezzel, mint primerrel szintetizált cDNS-t hibridizá- 35 ciós mintaként alkalmazzák Namalwa-sejt klóntár átvizsgálására és az interferon-szekvenciákat tartalmazó kiónok azonosítására. E tridekanukleotidot tartalmazó IFN-oC gének a LelFN B, C, D, F, G; a LelFN A-ban 40 és H-ban a 13-ból csak 12 nukleotid van meg [Nature, 290, 20-26 (1981)]. A 2 069 970 számú nyilvánosságra hozott nagy-britanniai szabadami leírásban hasonlóképpen javasolják, hogy kiválasztott 45 oligonukleotidokat, például olyan oligonukleotidot, amelynek szekvenciája a fibroblast- és leukocita-interferon-génnel közös, alkalmazzanak emberi kromoszóma-géntárakban lévő vagy teljesen genomikus DNS restrikciós 50 hasításával kapott, különböző interferon-gének felismerésére és izolálására. Továbbá a 0.076.489 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi leírásban azt javasolják, hogy egy radioaktiven jelzett, 55 szintetikus oligonukleotidot, például a fent említett tridekanukleotidot, vagy egy radioaktiven jelzett oC- és /3-specifikus IFN-cDNS-t, például egy olyan cDNS-t, amelyet az említett tridekanukleotiddal, mint primerrel 60 szintetizáltak, kromoszómális IFN-cC és IFN-J3- -géneket tartalmazó telepek azonosítására szondaként használjanak. A fent említett tridekanukleotid segítségével és az előzőekben ismertetett módszer 65 alkalmazáséval sikerült az új IFN-oC2(Arg)-t 3
