196414. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 1H,3H-pirrolo-[1,2-c]tiazol származékok előállítására
5 196414 6-3-glicero-foszforil-kolin (.P.A.F.-acéther tritié*) megkötését: a) Mosott vérlemezkék készítése nyúl véréből: Körülbelül 2,5 kg súlyú, hím új-zélandi nyulakból (HY 2000-es hibridekből) vért vettünk a fül melletti artérián keresztül. A vért összegyűjtöttük egy olyan elegyre, amely 1,9 mM citromsavat, 9 mM trinátrium-citrátot, 1,75 mM mononétrium-foszfátot és 5,6 mM dextrózt tartalmazott. A vért 150 g-vel centrifugáltuk 20 percen keresztül, 15 °C-on. Ilyen módon vérlemezkékben gazdag plazmát (PRP) kaptunk. Ezt a plazmát 1000 g-vel centrifugáltuk 15 percen keresztül 15 °C-on. A vérlemezkéket tartalmazó üledéket, amely ilyen módon keletkezett, először módosított Tyrode-oldattal mostuk, amely 0,35% mennyiségben marhavérből előállított albuminszérumot (BSA), 2 mmol MgCk-ot, 0,2 mmol EGTA-t tartalmazott. Másodszor EGTA nélküli Tyrode oldattal hajtottuk végre a mosást. A vérlemezkéket végül szuszpendóltuk egy pufferoldatban. A vérlemezkéket végül szuszpendáltuk egy pufferoldatban (.A’ pufferoldat), amelynek az összetétele a következő volt: 140 mmol nátrium-klorid, 2,7 mmol káliura-klorid, 0,4 mmol nátrium-dihidrogén-foszfát, 2 mmol magnézium-klorid, 12 mmol nétrium-hidrogén-karbonát, 10 mmol .Trisz HCl", 6,2 mmol dextróz és 0,25% BSA. A szuszpenziónak a végkoncentrációját 4x10* vérlemezke/cm3 értékére állítottuk be ennek a pufferoldatnak a segítségével. b) A teszt végrehajtása: Egy 5 cm^es kémcsőbe belehelyezzük egymás után az előzőleg ismertetett .A’ puffert, a vizsgálandó anyagot, 0,5 mmol .PAF-acéther tritié'-t (fajlagos aktivitása: 80 Ci/mmol), valamint a korábban ismertetett módon készített vérlemezkéket (0,5x10* vérlemezkét) olyan módon, hogy a vértérfogat 0,5 cm3 legyen, majd az elegyet egy óra hosszat inkubáljuk 20 °C-on. Az elegyhez ezután hozzáadunk 2 cm3 mennyiségű, 4 °C-ra hűtött .A' puffert, majd a kémcső tartalmát gyorsan leszűrjük egy WHATMAN CF/C védjeggyel ellátott szűrön, majd a kémcsöveket nagyon gyorsan háromszor kiöblítjük 4 °C-ra lehűtött, 2-2 cm3 mennyiségű .A" pufferoldattal. A szűrőt megszárítjuk és egy fiolába helyezzük, amely 4,5 cm3 READY SOLV. MP (N. D. BECKMAN) szcintilláció folyadékot tartalmaz, és mérjük a radioaktivitást egy RACK BETA 1218 LKB jelzésű univerzális számlálóval. iGy meghatározzuk a teljes .kötött ' radioaktivitást. A .PAF-acéther tritié' fajlagos megkötódését úgy határozzuk meg, hogy kivontuk a teljes kötött radioaktivitásból azt a radioaktivitási értéket, amelyet azután mértünk a szűrőn, hogy rávittünk 10 /umol N-(3-metoxi-fenil)-3-(3-piridil)-lH,3H-pirrolo[l,2-c]tiazol-7-karboxamidot. Minden egyes vizsgált anyagra vonatkozóan háromszor hajtottuk végre ezt a vizsgálatot, 10-10 - 10"4 értékek közötti, növekvő koncentrációkkal. Minden egyes vizsgált anyagra vonatkozóan grafikusan határoztuk meg a CIso-értéket az inhibiciós görbéből. Tudjuk, hogy a PAF-acéther szerepet já'szik sok betegségben és bajban, igy az allergiás megbetegedésekben (asztmában vagy bronchitiszben) vagy az emésztőszervek nyálkahártyáinak gyulladásos megbetegedéseiben (amelyek különböző eredetűek lehetnek), valamint a besugárzások és endotoxinikus sokkok következtében fellépő gyulladásos reakciókban, továbbá a vérlemezkék összetapadásával kapcsolatos megbetegedésekben. Az ezeknek a rendellenességeknek a következtében felszabadult PAF-acéther rögződik ennek a közvetítöanyagnak a speciális receptorain. A vérlemezkéknek a receptorokon való megkötődésének vizsgálatéra szolgáló, az előzőekben ismertetett teszt egyike azoknak a kísérleti modelleknek, amelyekkel vizsgálható, egy különböző vegyületek milyen mértékben hajlamosak megkötődni ezeken a r€ cepto rokon. A találmányunk szerint előállítható térin bkek kiszorítják a PAF-acéthert ezekről a kötési helyekről, ennek következtében tehát versengenek a PAF-acétherrel és akadályozzak annalf a hatásét. Ennél fogva előre látható, hogy a találmányunk szerint előállítható vegyületek gyógyító hatást fejtenek ki az előbb felsorolt betegségek és állapotok kezelése során. Ismeretes már a 0 115 979. sz. európai szabadalmi leírásból, hogy vannak olyan pirrolotiazol-származékok, amelyek bizonyos inti: bitéló hatást fejtenek ki a PAF-acétherrel szemben. A találmányunk szerint előállítható vegyületek azonban kisebb mennyiségben kitődnek meg a vérlemezkék receptorain és ennek következtében alkalmasabbak a PAF-acéther hatásainak gátlásában mint a 0 115 979. sz. európai szabadalmi leírásban s :ereplő pirrolotiazol- származé kok. Mindemellett a találmányunk szerint előó'litható vegyülteknek kicsi a mérgező hatásuk. Szájon keresztül alkalmazva őket a DLso é-tékük általában 300 és 900 mg/kg értékek között van egerek esetében. A találmányunk szerint előállítható vegyületek molekuláiban az alkilcsoportok vagy aí alkil-részek 1-4 szénatomot tartalmaznak és egyenes vagy elágazó láncúak lehetnek. A találmányunk szerint előállított vegyületek rleérnek, enantiomerek vagy az enantiomerek e'egyei lehetnek. Nagyon hatásosak azok a vegyületek, amelyeknek molekuláiban az Ar csoport egy halogénatommal vagy egy alkilcsoporttal helyettestett piridilcsoport. Különösen hatásosak a következő vegyületek: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
