196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
1 196 242 2 sejtmintákat a 3., illetve 1. táblázathoz adott leírás szerint kaptuk. 10s Verő sejtet 1. típusú Herpes simplex vírussal fertőztünk. A sejteket a fertőzés után 20 órával gyűjtöttük össze, amidőn a cytopathiás (sejtre ártalmas) hatást már megfigyelhettük. A mintát a következőkben úgy kezeltük, ahogyan azt az adenovírusokkal fertőzött sejtek esetére leírtuk (az 1. táblázathoz adott leírás szerint). Bacillus amyloliquefaciens minta: A 4. táblázathoz adott leírás szerint. A táblázatban megadott értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttén-hibridizálási értékeket levontuk. 6. példa Escherichia coli kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével (6. táblázat) A reagenseket az Escherichia coli ompA-génjéból (külső membránfehérje A-gén) állítottuk elő. A kiinduló anyagként használt pKTH40 és pKTH45 hibrid plazmidokat a Henning és munkatársai által leírt pTUlOO plazmidból készítettük (Proc. Na ti. Acad. Sei. USA 76,4360 (1979)/. A szúróreagensként alkalmazott pKTH45 plazmid (Országos Közegészségügyi Intézet, Helsinki, No. EH 254 számmal letétbe helyezve) 740 bázispárt tartalmazott a pBR322 plazmidba beépített ompA-gén 5'-terminálisából. A pKTH40 plazmid 300 bázispárt tartalmazott az ompA-gén 3'-terminálisából és közvetlenül ezután 1400 bázispárt az E. coli genómájából. A pKTH40 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel hasítottuk az E. coli DNS-fragmentumának előállítása végett, amely a fentebb említett 1700 bázispárt tartalmazta. E fragmentumot az M13mp7 egyszálú bakteriofágra vittük át Messing és munkatársai módszerével (Nucl. Acids Res. 9, 309, (1981)/, valamint Heidecker és munkatársai (Gene 10, 69 (1980)/, továbbá Grandner és munkatársai (Nucl. Acids Res. 9,2871 (1981)/ eljárásai szerint. Az mKTH1207 rekombináns fágot (Országos Közegészségügyi Intézet, Helsinki, No. EH 256 számmal letétbe helyezve) a fentebb leírtak szerint („Egyéb, jelzésre használt módszerek”) mJ-izotóppal jelöltük és így alkalmaztuk a sandwich hibridizálási eljárás során. A 6. táblázat mutatja, hogy elroncsolt E. coli sejtekből származó DNS, valamint E. coli-ból származó, elkülönített, tisztított DNS kimutatható a sandwich hibridizálási eljárással. 6. Táblázat Escherichia coli kimutatása a sandwich hibridizálási eljárással Szúr6k(cpm) Minta 1) ompA 2) Borjú-thymus 3) Vakpróba E. coli K12 HB 101 DNS a) 2X107 E. coli K12 HB 101 DNS 282 “ a) 2x10» E. coli K12 HB 101 sejtek 2206 b) 2 x10» E. coliK12 HB 101 sejtek 1113 b) 2 x10» a) a DNS-molekulák száma b) a sejtek száma 2327 12 5 Szűrők: 1) 1,088 pg pKTH45 plazmid (2 X1011 molekula) 2) 1,088 pg borjú-thymus-DNS 3) Vakpróba (NDS nélkül) Jelzett nukleinsavreagensek: mKTH1207, fajlagos aktivitás 8xl07 cpm/pg- DNS (200 000 cmp/reakció) Hibridizálás: 4xSCC, lxDenhardt-oldat szarvasmarha-szérumalbumin nélkül, 0,25% SDS, 200pg/ml heringsperma*DNS, 17,5 óra 65 °C hőmérsékleten. Mosás: Az 1. táblázathoz adott leírás szerint. Minták: Az E coli. K12 HB101 DNS-t aMarmur-eljárással különítettük el 1(3. Mól. Bioi, 3,208 (1961)/, és a DNS-t 7 mmól-os nátronlúggal 100 °C hőmérsékleten 5 percig denaturáltuk. A sejteket 500 p/ml lizozimmel, majd EDTA-val (70 mmólos, 37 °C hőmérsékleten 30 percig), SDS- vel (Q,25% 65 °C hőmérsékleten) kezeltük, és a szabad DNS-t 134 mmólos nátronlúggal 100 °C hőmérsékleten 5 percig melegítve denaturáltuk. . 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9
