196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196 239 2 pH=5 és 9 között. 15 °C és40°C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. A pEL103 plazmid lehető legnagyobb másolatszámban való előállítására azonban a táptalaj pH-ját kezdetben 7,2-re állítjuk be, és a tenyészet hőmérsékletét 30°C-on tartjuk. Ha a Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL 103 törzset a fenti körülmények között tenyésztjük, úgy olyan sejttömeget kapunk, amelyből a pEL 103 plazmid könnyen izolálható. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban példákkal szemléltetjük. /. példa A pELI03 izolálása A) A Streptomyces granuloruber A300I2.13/ p E1.103 tenyésztése A Streptomyces granuloruber A399I2.I3/ pEL103 (NRRI 12549) törzs vegetatív inokulumának előállítására a sejteket süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük, 50 ml táptalajban. A táptalajt Trypticase szójából (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) és ionmentes vízzel készítjük, a szója koncentrációja 35 g/1. Az inokulumot 48 órán át 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük. A tenyésztést követően 10 ml inokulummal 500 ml steril táptalajt oltunk, ezt 20 órán át 30°C hőmérsékleten növesztjük. A táptalaj pLI-ját nem állítjuk be. A tenyésztést követően a Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL103 sejtekből izolálhatjuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat. B) A plazmid izolálása 12 g nedves súlyú Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL103 sejtet centrifugálássai összegyűjtjük. A centrifugálást 4°C hőmérsékleten, 10 percen át másodpercenként 10000-et forduló rotorban végezzük. A sejtekhez 50 ml TES-puffert adunk (0,01 mól trisz-(hidroxi-mctil)-amino-etén. 0,00 mól EDTA, 34% szacharóz, pH =8). Ezután 0,25 g, 10 ml 0,25 mólos EDTA-ban oldott lizozimot adagolunk. 15 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a szuszpenziót, ezután 0,5 ml, TE-pufferban oldott 10%-os Triton X— 100-at adagolunk, a TE-puffer összetétele a következő: 0,01 mól trisz és 0,001 mól EDTA, pH=8. A kapott clcgyet 15 percen át 65 CC hőmérsékleten melegítjük. A lizátumot 45 percen át 4°C hőmérsékleten, percenként 18000-et forduló rotorban centrifugáljuk, a felülúszőt izoamin-alkohollal négyszer extraháljuk, az extrakciót kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével megismételjük. Ezután 0,5 ml 3 mólos nátrium-acetátot adunk a vizes fázishoz, majd 3 térfogat hideg (—20°Chőmérsékletű) 95%-os etanolt. Az etanolos kicsapást szárazjég és etanol elegyében végezzük, a dezoxiribonukicinsav csapadékot centrifugálássai gyűjtjük össze. A centrifugálást 15 percen át 4°C hőmérsékleten végezzük olyan rotorban, amely percenként 10000-et fordul. A csapadékot csökkentett nyomású térben szárítjuk, majd 1,1 ml STE-pufferban oldjuk. A puffer összetétele a következő: 0,01 mól trisz, 0,001 mól EDTA, 0,01 mól nátrium-klorid. Ezután 40 órán át 15°C hőmérsékleten, percenként 35 000-et forduló centrifugában, cézium-klorid gradiensen centrifugálunk, etidium-bromid jelenlétében. így tisztítjuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat. Centrifugálásután a pEL103 dezoxiribonukleinsavat reprezentáló sávot elkülönítjük, és az ctidium-bromidot ismert módon extraháljuk. A dezoxiribonukleinsavat 3 térfogat etanollal kicsapjuk, és az így izolált pEL103 plazmid dezoxiribonuklcinsavat 1 ml tízszeresen hígított TE-pufferban oldjuk és — 20°C hőmérsékleten tároljuk. 2. példa A pI.R2 plazmid előállítása A) A pl Jő pi.-rmid emésztése Hindi II enzimmel 20 pl (20 pg) pl.16 dezoxiribonukleinsavat (lásd Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525, 1980.), 5 pl borjúszérum albumint (l mg/ml), 19 pl vizet és 1 pl, 3 New England Bio Labs. egységet tartalmazó Hindii! restrikciós enzimet és 8 pl reakcióelegyet* 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. A restrikciós enzimeket az alábbi helyekről vásároltuk: New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Road Beverly, Massachusetts 01915 Boehringer—Mannheim Biochemicals 7941 Castleway Drive Indianapolis, Indiana 46250 Bethesda Research Laboratories Inc. P. O. Box 577 G a i thersbu rg, Mary 1 a nd 20760. A reakciót 50 pl 4 mólos ammónium-acetát és 200 pl 95%-os etanol adagolásával állítjuk le. A kapott dczoxiribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 20 pl TE-pufferban szuszpendáljuk és — 20 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pBR322 plazmid emésztése HindiII enzimmel 8 pl (4 pg) pBR322 plazmid dezoxiribonukleinsavat, 5 pl reakcióelegyet (lásd előbb), 5 pl, 1 ml/ ml töménységű marhaszérum-albumint, 31 pl vizet és i pl Hindlll restrikciós enzimet elegyítünk, és az clcgyet 2 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítását 10 percen át60°C hőmérsékleten végezzük. Ezután 50 pl ammónium-acetátotés200 pl 95%-os etanolt adagolunk. A kapott dczoxiribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 45 pl vízben szuszpendáljuk. *-A Hindlll restrikciós enzim rcakcióclegye a következő: 600 minői nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9 70 mmól magnézium-klorid 10 mmól ditio-kreitol. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 65 7
