196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 C) A Hindii! enzimmel emésztett pBR322 és pIJ6 plazmiduk ligálása 20 fii Hindin enzimmel kezelt plJ6 plazmidot (2A. példa). 20 pl Hindii! enzimmel kezelt P|BR322 plazmidot (2B. példa), 5 pl. I mg/ml töménységű borjúszérum-albumint, l pl T4 dezoxiribonukleinsav-ligázt*, továbbá 5 pl ligációs elegyet** elegyítünk, és az elegyet 16 °C hőmérsékleten 4 órán át inkubáljuk. A reakciót 50 pl 4 mólos ammónium-acelát és 200 pl 95%-os ctanol adagolásával állítjuk le. A kapott dezoxiribonuklcinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és TE-pufferban szuszpcndáljuk. A szuszpendált dezoxiribonuklcinsav tartalmazza a pLR2 plazmidot. 3. példa Az E. coli kl2 HB101/pLR2 előállítása 10 ml, fagyasztott, kompetens E. coli K12 HB101 sejtet (Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 75 — 93, 1977) centrifugálással összegyűjtünk és 10 ml 0,01 mólos nátriuin-klorid-oldatban szuszpendálunk. Ezután újra centrifugáljuk a szuszpenziót, 10 ml 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk a sejteket, és 20 percen át jégfürdőben inkubáljuk. Újracentrifugálunk, a sejteket 1,25 ml 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. A kapott sejtek alkalmasak a következő transzformálásra. A 2C. példában előállított és TE-pufferban oldott pRL2 plazmidot etanollal kicsapjuk, 150 pl 30 mmólos kalcium-oldatban oldjuk, és 200 pl kompetens E. coli K12 HB101 sejttel enyhe rázással keverjük. A kapott elegyet 45 percen át jégfürdőben, majd 1 percen át 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 3 ml L-levest (Bertani, J. Bacteriology, 62, 293, 1951.) adagolunk, amely 50 ug/ml ampicillint tartalmaz. Az elegyet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten rázzuk, majd L-agarra szélesztjük (az L-agarra vonatkozóan lásd: Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York, 1972.), Az L-agar szintén tartalmaz ampicillint. A túlélő telepeket szelektáljuk, és vizsgáljuk a várt fenotípusra (AmpR, Tets). így megkapjuk az E. coli K12 HB101/pLR2 transzformánsokat. 4. példa A pLRI plazmid előállítása A pLRI plazmid előállítására a 2A—2C. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különb *=A T4 dezoxiribonukleinsav-ligázt az alábbi helyen vásároltuk: New England Bio Labs., Inc. 32 Tozer Rd. Beverly, Massachusetts 01915. **=A ligációs elegy az alábbi összetételű: 500 mmól trisz-hidrogén-klorid. pl 1—7.8 200 mmól ditio-treitol 100 mmól magnézium-kloríd 10 mmól ATP. seggel, hogy a pU2 plazmidot használjuk (Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525, 1980.), a pl.16 plazmid helyett. A kapott pLRli plazmidot TE-pufferban oldjuk. 5. példa Az E. coli K12 HBIOl/pLRI előállítása A 3. példában megadottakat ismételjük meg. azzal a különbséggel, hogy a pLR2 plazmid helyett api Rl plazmidot használjuk a transzformáláskor. A túlélő telepeket szelektáljuk, és a várt fenotípusokra (Ampl!, Tets) vizsgáljuk. így megkapjuk az E. coli K12 HBlOl/pLRl transzformánsokat. 6. példa A pLR4 plazmid előállítása A) A pl Rl plazmid részleges emésztése BamHI enzimmel 10 pl (10 iig) pLRI plazmidot, 5 pl marhaszérum-albumint (1 mg/ml), 29 pl vizet, 1 pl, vízzel. 1:4 arányban hígított BamHI restrikciós enzimet' és 5 pl reakcióelcgyet* elegyítünk, az elegyet 15 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakciót 5(1 pl 4 mólos ammónium-acetát ésj 200 pl 95%-os ctanol adagolásával állítjuk le. A kapott dezoxiribonuklcinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 20 pl vízben szuszpendáljuk. B) A pBR322 plazmid emésztése BamHI restrikciós enzimmel Az emésztést a 2B. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a Hindi11 restrikciós enzim helyett BamHI restrikciós enzi-. met használunk. A pBR322 emésztett plazmidot 29 pl vízben szuszpendáljuk. C) A BamHI enzimmel részlegesen emésztett pLRI plazmid és a BamHI enzimmel emésztett pl R322 plazmid ligálása \ ligációs reakciót a 2C. példában megadottak szt rint végezzük. Az összekapcsolt dezoxiribonuk-. leinsavat TE-pufferban szuszpendáljuk, így megkapjuk az. előállítani kívánt pLR4 plazmidot. 7. példa Az E. coli KÍ2 HBlOHpLR4 előállítása Az előállítást a 3. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pLR2 plazmid helyett a transzformációkor pLR4 plazmidot használunk. A túlélő telepeket a várt fenotípusra (Amp'L Tets) szelektáljuk, így megkapjuk az E. coli KI2 HBI0l/pLR4 transzformánsokat. *-A BamHI restrikciós enzimhez használt reakcióclegy összetétele a következő: 1.5 mól nátrium-klorid 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9 60 mmól magnézium-klorid. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
