196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196 239 2 I. Tábíúznt Jellemző pl izmidok Példa száma Plazmid neve Nagyság kh-ban Előállítás 35 pFJ 152 6,9 a pFJ 145 BclI-BamHI deléciója 36* pFJ153 8,3 apBR322 BamHl-fragmensének ligálása a BamHI enzimmel emésztett pFJ 124-be 37* pFJ154** 11,7 a pBR322 BamH! fragmensének ligálása a BamHI enzimmel részlegesen emésztett pFJ 144-be 38* pFJ155** 11,7 a pBR325 BamHI fragmensének ligálása a BamHI enzimmel részlegesen emésztett pF) 145-be 39 pFJ 156 8,3 a pFJ 153 fordított orientációja 40 pFJ157 11,7 a pFJ 154 fordítót orientációja 41 pFJ 158 11,7 a pFJ 155 fordítót orientációja 42 pFJ159 6,5 a pl143 2,7 kb nagyságú Sail — Bg III fragmensének ligálása a pFJ 124 Sáli—Bell enzimmel valóemés: ’esc után kapottfragmensébe 43* pFJ160*** 11,0 a pBR322BamH? fragmensének liga!ásaapFJ159BamHI részlegesen emésztett fragmenséhez 44 pFJ161 11,0 a pFJ160 fordítót* orientációja 45* pFJ162*** 11,3 a pBR325 BamFJ fragmensének ligálása a pF.l 148 plazmid BamHI enzimmel való részleges emésztésekor kapott fragmenséhez 46 pFJ163 11.3 a pFJ 162 fordított orientációja 47* pFJ177*** 11,3 a pBR322 BamFII fragmensének ligálása a BamHI enzimmel részlegesen emésztett pFJ 149-hez 48 pFJ177*** 11,3 a pFJ 177 fordított orientációja 49* pFJ179 7,1 a pBR322 BamHI fragmensének ligálása a Pel 105 2,8 kb nagyságú BamHI fragmenséhez 50 pFJlBO 7.1 a pFJ179 fordított orientációja 51 pFJ191 3,5 a pFJ124 Bell —BamHI deléciója *=a pBR dezoxi-ribonukleinsav orientációja azonos a 16. ábrán a pFJ 150 kapcsán megadottal. **=a BaniHI helyre való beépülés úgy történik meg, hogy a pBR dezoxi-ribonukleinsav a ncomiein-rezisz =tenciát meghatározó gén- és tiostrepton-rezisztenci;'t meghatározó gén Bell helye közé esik. ***=a BamHI helyre való beépülés úgy történik meg, hogy a pBR dezoxi-ribonukleinsav az eritromicin-re^ zisztenciát meghatározó gén cs a pFJ Pstl helye közé esik. //. Táblázat A legfontosabb transzformánsok 1) Sreptomvces R/R1, ahol R ambofaciens, aureofaciens, griseofuscus, fradiae, lividans, granuloruber, tenebrarius vagy cinnamonensis, cs ahol R* az előzőektől függetlenül az !. táblázatban megadottak pFJ plazmid. 2) E. coli R-7R-\ ahol R- kl2 vagy kl2 HBIOi sejt, és ahoi R3 az előzőektől függetlenül pFJ153, pFJ154, pFJ 155, pFJ156. pFJ157. pFJ158, pFJ160, pFJlöt, pFJ162, pFJ163. pFJ177, pFJ!78, pFJ 179 vagy pFJlBO plazmid. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás pEL103 plazmid izolálására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces granuloruber A39912.13 (NRRL 12549) törzset süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük 5—9 közötti pH-n és 15 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, a tenyészetből elkülönítjük a sejteket, ezeket a sejteket lizáljuk, a lizátum felülúszóját oldószerrel extraháljuk, az extraktumból kicsapjuk a plazmid 40 dezoxiribonukleinsavat, és a csapadékból a pELi()3 plazmídot elkülönítjük. (Elsőbbsége: 1981. 10. 15.) 2. Eljárás Strcptomycesben és kívánt esetben E. coli-bán működőképes rekombináns dezoxiribonukleinsav klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy érzékeny gazdasejtbe transzformálva legalább egy antibiotikumra rezisztenciát meghatározó egy vagy több dezoxiribonukleinsav szegmenst hozzákapcsolunk a pEL103 plazmid 50 vagy valamely DNS szegmenssel bővített pEL103 plazmid valamely restrikciós fragmenséhez és kívánt esetben valamely E. coli működni képes repükont tartalmazó restrikciós fragmenshez és klónozó vektor előállítására a kapott rekombináns 55 dezoxiribonukleinsavat önmagával összezárjuk. (Elsőbbsége: 1981. 10. 15.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pEL103 restrikciós fragmenseként a 2,8 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst használ-6° juk. (Elsőbbsége: 1981. 10. 15.) 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pEL103 restrikciós fragmenseként a 19,9 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmenst használjuk. (Elsőbbsége: 1981. 10. 15.) 5. A 2—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukle-15
