196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 Ügyanakkor két orientációjú rekombináns pfazmidot is kapunk, mivel a 3,4 kb nagyságú BamHJ neomicin rezisztenciát hordozó fragmens két irányban orientálódva épülhet be. A pEL115 és pELlló plazmidok restrikciós helyeit és funkcionális térképét a 10. ábrán adjuk meg. 15. példa A Streptoinyces ambofuciens/pELl 15 és S. ambofaciensIpELI 16 előállítása 20 pg, a 14. példában előállított dezoxiriboruikleinsavva! végezzük a kísérletet a 13. példában megadottak szerint eljárva. A kapott Streptoinyces ambofaciens/pEL.115 és S. ambofaciens/ pELl 16 tiostrepton és neomicin rezisztens telepeket ismert módon izoláljuk, és ezután restrikciós enzimmel és elektroforézissel kivitelezett analízissel azonosítjuk a konstitutív plazmidokat. 16. példa A pELlll és pELUH plazmidok és a pELl 19 és pELI20plazmidok előállítása A plazmidokat a 12., illetve a 14. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pEL107 és pEL!05 plazmidok helyett a pEL108 és pEL104 plazmidokat használjuk a részleges Bambii emésztés során. A ,pEL!17, pELIÍ8, pELil.9 és pEL120 plazmidok beépülés! izomerjeit is megkapjuk, mivel a pEL108 és pEL!()4 plazmidok húrom Bandii restrikciós helyet tartalmaznak, ahova a neomicin rezisztenciát meghatározó gént hordozó fragmens beépülhet. Két orientációjú plazmádhoz jutunk, mivel a 3,4 kb nagyságú BamHI neqjnicin rezisztenciát hordozó fragmens két irányban orientálód: va épülhet be. A pELH7 és pEL118 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a 11., a pEL119 és pEL120 plazmidokéí pedig a mellékelt 12. ábrán adjuk meg. 17. példa A Streptoinyces ambofaciens!pELI 17 és S. ambofaciens!pELU8 és a Streptoinyces ambofaciens!pEL119 és S. ambofaciens!pE,L!20 törzsek előállítása A 16. példában megadottak szerint előállított 20 pgpELl 17, pELl 18, pRLM9 és pEL120dezoxiribomikleinsav eleggyel a 13. és 15. példában megadottak szerint eljárva Streptoinyces ambofaciens sejteket transzformálunk. A kapott Streptomyces ambofaeiens/pELl 17, S. ambofaciens/ pELllS, S. ambofaciens/pEL119 és S. ambofaciens/pEL120 tiostreptonra s neomicinre rezisztens telepeket ismert módon izoláljuk, és restrikciós enzimes és elektroforetikus analízissel azonosítjuk a konstitutív plazmidokat. 18. példa A pEL12l és pEL122 kimer plazmidok előállítása A fenti kimer plazmidok előállítására a pELI07 plazmád részleges BamHIenzimmel valóemésztésekor kapott fragmensekeí hozzákötjük a pBR322 plazmid BamHI fragmenseihez. Az eljárást a 8C. i példában megadottak szerint végezzük. A pEL107 plazmidot a Strepcomyces ambofaciens/pEL107 (lásd a 9. példát) törzsből izoláljuk az 1. példában megadottak szerint eljárva, majd a 8B. példában megadottak szerint BamHI restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük. A pBR322 plazmid BamHI íragmenscil a 2B. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a HindlII enzim helyett BamHI restrikciós enzimet haszná- ; lunk. A kapott kimer plazmid dezoxiribonukleinsaval centrifugálissal összegyűjtjük, 70%-os etanoilal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezt követően 50 pl TE-pufferban szuszpendáljuk. Megkapjuk a pF.L121 és pEL122 plazmidok beépülési izomerjeit is, mivel a pEL107 plazmid két Bam.í' restrikciós hellyel rendelkezik, ahova a pBR322 plazmid emésztést követően beépülhet. A rekombináns plazmidokat két orientációban kapjuk meg, mivel a pBR322 mindkét orientációban beépül. A pEL!21 és pELI22 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a 13. mellékelt ábrán adjuk meg. 19. példa Az E. coli K12 HB101IPEL121 és az E. coli K12 ! HBIO!IpELl22 előállítása Az eljárást a 3. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pLR2 plazmid helyett a pELI2l és pÉL122 plazmidokat használjuk a transzformációhoz. A túlélő telepeket először a várt fenotípusra (AmpR, Tets) szelektáljuk és vizsgáljuk, majd a kapott E. coli K12 HB101/pEL12l cs E. coli K12 HBI01/pEL122 transzformánsokat restrikciós enzimmel és gél- , elektroforézissel analizálva azonosítjuk. 20. példa A Strepiomyc.es ambofaciens/pELl21 és S. ambofaciens/pEL!22 előállítása A 9. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pEL107, pEL105, pELh)8, és pEL104 plazmidok helyett a pEL121 és pEl.122 plazmidokat használjuk. A kapott transzformánsokat a 9. példában megadottak szerint tiostrepton rezisztenciára szelektáljuk. Az így előállított, tiostreptonra rezisztens Streptoinyces ambofaciens/pEL12! cs S. ambofaciens/pEL 122 telepeket ismert módszereket használva izoláljuk, és restrikciós enzimes és elektroforetikus analízissel azonosítjuk a konstitutív plazmidokat. 21. példa A pFJ!24 plazmid előállítása A) A pEl.105 plazmid részleges BamHI és Bell emésztése. 20 pg pEL105 dezoxiribonukleinsavat, 10 pl reakcióelegyet (lásd előbb), 10 pl, 1 mg/ml töménységű marhaszérum albumint, 39 pl vizet és 5 10 1E-20 2 0 30 33 40 45 EQ 55 90 65 11
