196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 í pl BamHI restrikciós enzimet (2 pl enzim és 8 pl víz hígításával állítjuk elő) elegyítünk, az elegyet 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Azonos térfogatú 4 mólos ammónium-acetát-oldatot és 2 térfogatnyi, 95%-os etanolt adunk a reakcióelegyhez, és ezután 18 órán át -20 °C hőmérsékleten tartjuk a dezoxiribonukleinsav kicsapására. A dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 20 pl TE-pufferban szuszpendáljuk. 5 pl Bell reakcióelegyet (lásd lentebb), 10 pl, 1 mg/ml töménységű marhaszérum albumint, 39 pl vizet és l pl, fölös mennyiségű New England Bio Láb, egységet tartalmazó Bell restrikciós enzimet adagolunk, majd 60 percen át 50°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Azonos térfogatú 4 mólos ammónium-acetát-oldatot és 5 térfogatnyi 95%-os etanolt adunk a reakcióelegyhez, majd -20’C-on tartjuk 18 órán át a dezoxiribonukleinsav kicsapására. A kívánt dezoxiribonukleinsavat centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és ezután 50 pl TE-pufferban szuszpendáljuk. A Bell restrikciós enzimhez használt reakciőelegy összetétele a következő: 750 mmól káiium-klorid 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH =7,4 100 mmól magnézium-klorid 10 mmól ditio-treitol. B) Ligálás 20 pg részlegesen emésztett pEL105 dezoxiribonukleinsavat, 5 pl ligációs elegyet, 5 pl, l mg/ml koncentrációjú marhaszérum albumint, 10 pl vizet és 1 pl T4 dezoxíribonukleinsav-iigázt inkubáiunk 16°C hőmérsékleten, 4 órán át. Ezután 40 pl 4 mólos ammónium-acetát-oldatot és 200 pl hideg etanolt adunk azelegyhez, majd -20 °C hőmérsékletre hűtjük, és 18 órán át itt tartjuk a dezoxiribonukleinsav kicsapására. A dezoxiribonukleinsav csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, ismét összegyűjtjük, és ezután 50 pl P-oldatban szuszpendáljuk, a transzformálásra. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy a pEL105 plazmid BamHI és Bell enzimekkel való részleges emésztésekor fragmensek keveréke keletkezik amelyek önmagukkal vagy egymással is kapcsolódhatnak, ily módon több különböző plazmid keletkezik. A pFJ124 plazmid a többi képződött plazmiddal együtt megfelelő gazdasejtekbe transzformálható, és ezután ismert módon azonosítható restrikciós enzimes és gclelektroforetikus analízissel. 22. példa A Streptomycin ambofaciens/pFJ/24 előállítása A kísérletet a 9. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 8C. példa szerinti dezoxiribonukleinsav helyett a 21. példában megadottak szerint előállított terméket használjuk. A kapott, tiostreptonra rczisztens Iranszformáns telepeket ismert módon izoláljuk, tenyésztjük, és ezután restrikciós enzimes és clektroforetikus analízissel azonosítjuk a konstitutív plazmidok il. A streptomyces ambofaciens/pFJ124 transzformánsokat ezután a pFJ124 plazmid előál-i lítására és izolálására ismert módon tenyésztjük. A körülbelül 4,0 kb nagyságú pFJ124 plazmid restrikciós helyeinek térképét a mellékelt 14. ábrán adjuk meg. 23. példa A pFJl44 és pFJ145 plazmidok előállítása A) A pFJ 124 plazmid emésztése BamHI enzim-, mel Az emésztést a 8A. példában megadottak sze-j rint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pLR2 plazmid helyett a pFJ124 plazmidot használjuk. A dezoxiribonukleinsav csapadékot 50 pl TE-pufferban szuszpendáljuk, ebben jelen vannak a BamHI enzim által hasított fragmensek. B) Ligái ás A 10A. példában megadottak szerint előállított, 3,4 ko nagyságú BamHI neomicin rezisztenciát hordozó restrikciós fragmenst hozzákötjük ai pFJ124 plazmid BamHI enzim hasításával kapott; fragmenseihez. A reakciót a 8C. példában meg-! adottak szerint végezzük. Két orientációjú rekom-,; binárs plazmidot kapunk, mivel a 3,4 kb nagyságúi BamHI rezisztenciát meghatározó fragmens két; orientációban épülhet be. A pFJ144 és pFJ145 plazmidokkai ismert módon gazdasejteket transzformálunk, és ezután a plazmidokat restrikciós enzimes és gélelektroforetíkus analízissel azonosítjuk. 24. példa « A Strcjnoniyces ambofaciens/pFJ]44 , és a S. ambofaciens/pFJ 145 előállítása All. példában megadottak szerint járunk el, azza! a különbséggel, hogy nem a 10. példában megadottak szerint előállított dezoxiribonukleinsava' használjuk, hanem a 23. példa szerint előállított terméket. A kapott Streptomyces ambofacietWpFJ144 és S. ambofaciens/pFJ145 neomicinre rczisztens telepeket ismert módon izoláljuk, tenyésztjük, vizsgáljuk tiostrepton rezisztenciájukat, majd ezután a konstitutív plazmidokat restrikciós enzimes és gélelektroforetíkus analízissel azonosítjuk. A transzformánsokat ismert módon tenyésztjük a pFJ 144 és pFJ145 plazmidok termelésé 'e és izolálására. A 7,4 kb nagyságú pFJ144 és pFJ Í45 plazmidok restrikciós helyeinek térképét a mefékelt 14. ábrán adjuk meg. 25. példa A pFJ 146 plazmid előállítása Az előállítást a 21. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pEL105: plazmid helyett a részlegesen emésztett pFJ144 plazmidot használjuk. A kapott dezoxiribonukieiíisuv csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os etanollal mossuk, ismét összegyűjtjük, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
