196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 A találmány funkcionális rcplikációs origin! tartalmazó pEI.103 plazmid restrikciós fragmcnsére. és egy vagy több. antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmcnst tartalmazó rekombináns dezoxiribonukleinsav klónozó vektorokra vonatkozik. A találmány továbbá vonatkozik a fenti vektorok Iranszformánsaira. A találmány szerinti Streptomyccs és rokon sejtekben használható, antibiotikum rezisztencia gént hordozó klónozó vektorokat állítunk elő. Mind ez ideig a fenti mikroorganizmusok rekombináns dezoxiribonukleinsav technológiájának fejlődése és kiterjesztése késlekedett, és különösen nehéz volt a klónozó vektorokon levő szelektálható genetikai markerek általános hiánya miatt. A találmány szerinti vektorok funkcionálisak cs szelektálhatok mind Streptomyccs, mind pedig más gazdatörzsekben, és így jelentős előrehaladást jelentenek. A találmány szerinti vektorok különösen előnyösen használhatók, mivel kicsik, sokoldalúak, transzformálhatok cs szelektálhatok bármely olyan Streptomyccs sejtben, amely szenzitív arra az antibiotikumra, amely antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordoz a vektor. Mivel a klinikailag fontos antibiotikumok több mint a felét Streptomyces törzsek termelik, különösen előnyös lenne ezen ipari szempontból jelentős mikroorganizmuscsoport klónozó rendszereinek és vektorainak kifejlesztése. A jelen szabadalmi leírásban ilyen vektorokat állítunk elő, így lehetővé válik a Streptomyccs sejtekbe gének klónozása ismert antibiotikumok termelésének növelésére és új antibiotikumok és antibiotikum-származékok előállítására. A találmány szerinti eljárással Streptomyccs gazdasejtekbe való dezoxiribonukleinsav klónozásra alkalmas hordozókat állítunk elő, továbbá lehetővé válik az eljárás alkalmazásával a (ranszformánsok könnyű szelektálása. Mivel a transzformáció igen alacsony gyakorisággal következik be, az ilyen lehetőség olyan gyakorlati szükségszerűség. amellyel a sok millió sejt közül meghatározhatjuk azt, hogy mely sejtek vették fel a plazmid dczoxiribonukleinsavat. Ez fontos, mivel a nem szelektálható dezoxiribonukleinsav-szekvenciák beépíthetők a vektorokba, és transzformációt követően megfelelő antibiotikumon való szelektálással izolálhatok azok a sejtek, amelyek tartalmazzák a vektort és az adott, számunkra érdekes dezoxiribonukleinsav-szekvenciát. A találmány ismertetése során az alábbi kifejezéseket használjuk: Rekombináns dezoxiribonukleinsav klónozó vektor: bármely autonom rcplikálódő molekula, ideértve, de nem limitálva, a plazmidokat, amely molekula egy dezoxiribonukleinsav-rcszből áll és amelyhez egy vagy több további dezoxiribonukleinsav-szegmenst lehet kapcsolni vagy kapcsoltunk. Transzformáció: dezoxiribonukleinsav bejuttatása egy recipicns (befogó) gazdasejtbc, amelynek a genetípusa megváltozik, és így stabil és öröklődő változás következik be a recipicns sejtben. Transzformáns: recipicns gazdasejt, amely transzformálódott. Érzékeny gazdasejt: olyan gazdascjl, amely nem képes növekedni egy adott antibiotikum jelenlétében. csak akkor, ha az illető antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmcnst juttatunk a sejtbe. i Restrikciós fragmens: bármely olyan lineáris vagy teljes plazmid, amelyet egy vagy több restrikciós enzim plazmidra való hatása során állítunk elő. Bcépülési izomer: két vagy több lehetséges rekombináns dezoxiribonukleinsav-molekula egyike, amely akkor keletkezik, amikor egy dezoxiribonukieinsav-fragmenst két vagy több lehetséges hely közül a befogó dezoxiribonukleinsav egy adott helyére építünk be. A pLR2 plazmid 1,6 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmense: 1,6 kb nagyságú, BamHI restrikciós enzimmel kihasítható, tiostrepton rezisztenciát meghatározó fragmens, amely a pIJ6 plazmidban van jelen. A pLRl vagy a pLR4 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmense: a pIJ2 plazmidban levő, 3,4 kb nagyságú, BamHI restrikciós enzimmel hasítható neomiein rezisztenciát meghatározó fragmens. AmpR: ampicillin rezisztens fenotípus. Tets: tetraciklin-érzékeny fenotípus. Thiok: tiostrepton rezisztens fenotípus. j Neou: neomiein rezisztens fenotípus. ; A találmány szerinti rekombináns dezoxiribonuklcinsav klónozó vektorok tartalmazzák i\ pEL 103 plazmid funkcionális replikációs originjé; hordozó restrikciós fragmenst, és Egy vagy több olyan dezoxiribonukleinsav-szegmenst, amely érzékeny gazdasejtbe transzformálva legalább egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát határozza meg, a gazdasejt érzékeny a transzformálásra, osztódik és tenyészthető. A találmány szerinti bifunkcionális, azaz E. coli Streptomyccs cs más sejtekben használható rekombináns dezoxiribonukleinsav klónozó vektorok tartalmaznak egy pEL103 plazmidból szárma^ zó, funkcionális replikációs origint tartalmazó restrikciós fragmenst, és egy vagy több olyan dezoxiribonukleinsáv-szegmenst, amely érzékeny gazdasejtbe transzforműlr va legalább egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát határoz meg; a gazdasejt alkalmas transzformálásra, sejtosztódásra és tenyésztésre, tartalmaz továbbá E. coli plazmidból származó funkcionális replikont tartalmazó és antibiotikum rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmenst. A találmány szerinti vektorok előállítására úgy járunk el, hogy egy vagy több, antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szeginenst és egy pEL103 plazmidból származó, replikációs origint tartalmazó restrikciós fragmenst összekapcsolunk; továbbá a bifunkcionális vektorok előállítására hozzákapcsolunk egy E. coli plazmidból származó, funkcionális replikont és antibio tikum rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmenst. A pELI03 plazmidból hasítjuk ki a replikát ciós origint tartalmazó fragmenst, ez a plazmid 20,0 kb nagyságú, és a molekuláris klónozáshoz különösen előnyösen használható restrikciós helyeket tartalmaz. Mivel a pEL103 plazmid replikációs originjét a 2,8 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmensen belül lokalizáltuk, több különböző 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 o
