196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196 239 2 replikációs origint tartalmazó fragmcns állít ható elő oly módon, hogy a plazmidot a 2,8 kb nagyságú BamMl szakaszon kívül restrikciós enzimekkel hasítjuk. A pELl()3 részletes restrikciós cs funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. A leírás során az első és a további ábrák nem méretarányosak. A pEL10.3 plazmidot a Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL103 törzsből izoláljuk. A törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében letétbe helyeztük. Innen plazmidforrásként NRRL42549. számon hozzáférhető. A Streptomyces granuloruber A399I2.13/pELl()3 a Streptomyces granuloruber A39912 törzsből származik. Ez a törzs szintén hordozza a pELií)3 plazmidot. és a fenti törzsgyűjteményben NRRL 12389. számon van letétbe helyezve. Bár számtalan különböző, replikációs origint tartalmazó pEL!03 fragmcns előállítható, a leírás során példaként a 2,8 kb és a 19,9 kb nagyságú BamHI restrikciósfragmenseket ismertetjük. Ezeket a fragmenseket egy vagy több antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxirjbonukleinsav fragmenshez kötjük. Ezt a reakciót a leírás során szemléltető jelleggel a pLR2 plazmidban lévő és tiostrepton rezisztenciát meghatározó, 1,6 kb nagyságú, BamHI restrikciós fragmensse! és a pLRl vagy pLR4 plazmidban lévő 3,4 kb nagyságú és neomicinnel szembeni rezisztenciát meghatározó BamHI restrikciós fragmenssel mutatjuk be a találmány szerinti vektorok előállítása kapcsán. A tiostrepton rezisztenciát hordozó fragmens forrása a pLR2 plazmid, ez 18,7 kb nagyságú, és úgy állítjuk elő, hogy a Thompson és munkatársai által ismertetett [Maturo, 286, 525 (1980)] píJ6 plazmidot Hindin enzimmel kezeljük, a fragmenseket pedig hozzákötjük a pBR322 plazmid Hindii! restrikciós enzimmel kapott fragmenseihez. A neomicin rezisztenciát hordozó fragmenst a pLRl plazmidból állítjuk elő, ez a plazmid 14,8 kb nagyságú és hasonlóképpen állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a píJ2 plazmidot {lásd: Thompson és munkatársai (1980] használjuk a pIJÖ plazmid helyett. Mind a pLR2, mm: pedig a pLRl plazmid E. coli sejtekben funkcionális, és így különböző célokra sokszorosítható és könnyen izolálható. Analóg módon állítjuk elő a pLR4 plazmidot, mégpedig oly módon, hogy a pBR322 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel kezeljük, majd a fragmenseket hozzákötjük a pLR 1 plazmid BamHI enzimmel kapott fragmenseihez. A pLR 1, pLR2 és pLR4 plazmidok restrikciós helyeit és funkcionális térképét a 2—4. mellékelt ábrákon adjuk meg. Kényelmi okokból és a könnyű előállítás érdekében a tiostrepton rezisztenciát hordozó, ! 6 kb. nagyságú BamHI fragmenst és a neomicin rezisztenciát hordozó, 3,4 kb nagyságú BamHI fragmenst a pEL!03 plazmid replikációs origint tartalmazó, 2,8 kb vagy 19,9 kb nagyságú Bah Hl restrikciós helyére építjük be. A kapott rekombináns dezoxiribonukleinsavat ezután köre zárjuk, amikor megkapjuk a találmány szerinti vektorokat szemléltető plazmidokat. A beépült dezoxiribonukleinsav fragmens orientációjától függően két orientációjú rckombináns plazmidot kapunk. így az 1,6 kb nagyságú pLR2 plazmidból kapott BamHI fragmens pEL103 plazmidba való beépülésekor megkapjuk a pEL!07 és a pEL105 plazmidokat. ugyanakkor a 3.4 kb. nagyságú BamHI fragmens beépítésekor a pEL109 és pELllO plazmidokhoz. jutunk. í ía mindkét plazmid beépül, úgy a pEL 113. pELl 14. pELl 15 és pELl 16 plazmidok.hoz jutunk. A fentihez hasonlóan, ha az 1,6 kb. nagyságú BamHI fragmenst hozzákapcsoljuk a pEL103 plazmid 19,9 kb nagyságú BamHI fragmenséhez, úgy megkapjuk a pEL108 és pEL104 plazmidokat; a 3,4 kb nagyságú BamHI fragmens ligálásával megkapjuk a pELÍll és pEL112 plazmidokat; mindkét fragmens ligálását követően a pEL117, pELl I.S.pELI 19éspE1.120plazmidokhozjutunk. A pELi0.3 plazmid különböző restrikciós fragmenseit haszu Vhatjuk fel az antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szcgmensekhez. való ligáláskor, azzal a feltétellel, hogy a 2,8 kb nagyságú BamHI restrikciós fragmens, amely tartalmazza a replikációs origint, jelen van. Példaként, de nem a találmány oltalmi körének szűkítése céljából, megemlítjük, hogy a pEL103 plazmid további restrikciós fragmenseit állíthatjuk elő, például a PstI, SpHI, Bglíl, Clal és Xhol restrikciós enzimekkel. Egy adott, antibiotikum rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmens nem csak egyetlen pEL103 plazmidból származó fragmens adott helyén található meg, hanem beépíthető és összeköthető különböző helyekre, csupán arra kell ügyelnünk, hogy a replikációs origin vagy más, a plazmidot szabályozó kritikus élettani funkciók ne sérüljenek. A szakember könnyen meghatározza azokat a szakaszokat, ahová egy adott dezoxiribonukleinsav-szegmens ligálható vagy beépíthető. Bár a tiostrepton és a neomicin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát hordozó dezoxiribonukleinsav-szegmcnsekként a jelen leírásban sorrendben az 1,6 kb és a 3,4 kb nagyságú BamHI, pLR2 illetve pLRl plazmidokbó! nyert restrikciós íragmenseket adjuk meg, a szakember számára nyilvánvaló, hogy akár egyenként, akár kombinálva további, tiostrcptonnal és neomicinnel szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsavszegmensek állíthatók elő. A pLR2 plazmid további tiostrepton rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmensei állíthatók elő például a 13 kb nagyságú Pstl replikációs fragmens, vagy az 1,6 kb nagyságú BamHI replikációs fragmens Bell szubfragmensének előállításával. A pLRl plazmid további neomicin rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukieinsav-szegmenseit kapjuk meg például akkor, ha előállítjuk a 3,5 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmens vagy a 3,4 kb nagyságú BamHI restrikciós framgens SstI—KpnI szubfragmensét. Más, hasonló vagy különböző antibiotikumokkal. például kl.orcmfenikollal, higromicinnel, viomicinnci, iilozinnaí, critromicinnel, stb. szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsavszegtnenseket is előállíthatunk és felhasználhatunk. Eriíromicin rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-s/egmcnsek például a következők: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6E 3
