196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 ’96238 2 ‘azután 1,0%-os nátrium-foszfórvolframát-oldattal (pH=7,6) egy percig kezeltük, majd szűrőpapírral .megszárítottuk. Az elektronmikrogrammokat Phillips E. N. 400 elektronmikroszkóppal készítettük, 77700-szoros nagyítással. A kapott negatív felvételről körülbelül 10-szeres nagyítással készítettünk pozitív képet (9. ábra). HBsAg-t exprimáió nem-litikus vektorok felépítése Olyan rekombináns plazmidokat gyűjtöttünk össze, amelyek a pML plazmidból [LuVky és Botéban, Nature 293, 79 (1981)] származó pBR322 szekvenciákat, a DNS-replikáció kezdeti zónáját, valamint korai és késői transzkripciós egységek promotor-szekveneiáját magába foglaló 348 bázispárok SV40—DNS~t és a HBsAg génjét kódoló HBV-szekvenciákat tartalmaztak. Az SV40 kezdő-helyét az SV40—DNS HindllI enzimmel való lebontása útján izoláltuk, és a HindlII-végeket konverter (AGCTGAATTC) hozzáadása útján EcoRI-végekké alakítottuk át. Ezt a DNS-t azután Pvull enzimmel hasítottuk és EeoRl-kapcsoiókat (linkercket) adtunk hozzá. EcoRl enzimmel való kezelés után a kezdőpontot átfogó, 348 bázis-párt tartalmazó fragmentet poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis és elektroelució útján elkülönítettük ,és pBR322-ben klónoztuk. A pHBs348 —E és 'pHBs348—L expressziós plazmidokat oly módon építettük fel, hogy a pHBV—T—1A plazmidból nyert HBV genom EcoRl és BglII enzimekkel való kezelése útján kapott és a HBsAg-t kódoló gént átfogó, 1986 bázis-párt tartalmazó fragmentet [vő.: Animal Virus Genetics (szerk.: Fields, Jaenisch és Fox) 5. fejezet, 57. old., Academic Press, N. Y. (1980] a pML plazmidba klónoztuk (vö.: Lusky és Botchan, i m.) az EcoRl és BamHl helyen. (A* pML plazmid a pBR322 oly származéka, amelyből deléció következtében hiányzanak a plazmid-replikációt majomsejtekben gátló szekvenciák, vö.: Lusky és Botchan, i.m.). A kapott plazmidot (pRI —Bgl) azután EcoRl segítségével linearizáltuk és az SV40 kezdő-tartományát képviselő, 348 bázis-párból álló fragmentet beviftiik pRI —Bgl plazmid EcoRl helyére. A kezdő-tartományi fragment bármelyik orientációban beléphet. Minthogy ez a fragment a replikáció kezdőtartomány mellett az SV40 korai és késői promotorait is kódolja, a HBV gének expressziója lehetséges volna bármelyik promotor irányításával, annak orientációjától függően (így pHBS348—E a korai promotor irányítása alatt exprimált HBS-t, pHBS348—L pedig a késői promotor irányítása alatt exprimált HBS-t képviseli). Az SV40—HBV plazmid replikációja majomsejtekben A HBV—SV40 rekombináns plazmidoknak a COS—7 majom-sejtvonalban történő replikációja a következő módon bizonyítható: A DEAE-dextrános módszerrel történő DNS- transzfekció után különböző időpontokban kis molekulasúlyú DNS-t különítettünk el Hirt [J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967)] módszere szerint, majd ezt agaráz-gélen elektroforézissel frakcionáltuk és Southern [J. Mól. Bioi. 98, (1975)] hibridizációs módszerével elemeztük a terméket. A 4. ábra mutatja, hogy közvetlenül a transzfekció után a COS-sejtekben összegömbölyödött plazmid alig vagy egyáltalán nincs jelen. Három nappal a transzfekció után azonban a bevitt DNS kiterjedt replikációja következett be, a pHBS348—L DNS („b” sáv) vagy pHBS348—E bevitelét követően. Amint várható volt, a pRI —Bgl plazmid transzfekcióját követően plazmid-replikáció nem volt megfigyelhető. [A pRI—Bgl plazmidból hiányoznak az SV40-kezdeti szekvenciák, egyébként azonban ez a plazmid azonos a fenti expresszió-plazmidokkal („a"'sávok)]. HBsAg szintézise rekombináns plazmidokkal transzfektált majomsejtekben A pML, pRI - Bgl, pHBS348-E és pHBS34SL plazmidoknak a COS—7 majom-sejtvonal [Guzman: Cell 23, 175 (1981)] sejtjeibe való bevitele során a DEAE-dextrános módszert [J. H. McCutchan és .1. S. Pagano: J. Nat. Cancer Inst. 41, 351 (1968)] annyiban módosítottuk, hogy a kezelési időt és a sejtek DEAE-dcxtránnal és DNS-nek való kitétdi idejéé 12 órára növeltük. A COS—7 sejtvonal az SV40 egy korai szakaszának egy integrált kópiáját fogadja magába és konstitutív módon exprimálja az SV40 A gén-terméket (T-antigén). Az SV40— DNS-rcplikáció egy funkcionális kezdőpontját tartalmazó plazmidokról kimutatták, hogy majomsejtekben SV40T-antigén jelenlétében replikálódnak [vö.: Myers és Tjian: Proc. Nati. Acad. Sei. (USA) 77, 6491 (1980); Lusky és Botchan: Nature 293, 79 (1981)]. Az 5. ábra mutatja, hogy a pHBS348—E és pHBS348—L plazmidokkal transzfektált COS-sejtek a 2. napon kezdték meg HBsAg szignifikáns mennyiségekben való expresszióját és két héten át folytatják ezt az expressziót. a pHBS348—L által irányított expresszió szintje valamivel magasabb, mint a pHBS348—E által irányított expresszióé. E kísérleti eredmények egyik lehetséges magyarázata az, hogy késői S V40 promotor talán hatásosabb ebben a rendszerben a korai promotornái. A szövetkultúrából származó HbsAg immunogén hatású az állatokban Miután kimutattuk, hogy a HBsAg szövetkultúrából származó részecskéi antigén-aktivitásúak, kívánatos volt megállapítani azt is, hogy vajon ezek a részecskék állatokban immunogén hatásúak-e. Ezért a COS—7 sejtek által termelt antigént ammónium-szulfáttal történő lecsapás, szacharózgrádiens centrifugálás és cézium-kloridos sűrűséggradiens centrifugálás útján tisztítottuk, majd a tisztított szövetkultúra-eredetű HBsAg-t injekció útján beadtuk egy kísérleti egér-csoport mindegyik egerének, míg a kontroli-csoport egereit a kereskedelemben beszerezhető humán szérumból származó HBsAg (a North American Biologicals Inc. cég készítménye) azonos mennyiségeivel immunizáltuk. Az immunizálás után különböző időpontokban meghatároztuk az anti —HBsAg titert az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
