196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2 CV—1 sejtek egy 150 mm átmérőjű lemezpt 90%-os összefolyásig tenyésztettük, majd egy eredeti transzfekciós kísérletből származó, rekombináns és tsA28 vírusokat egyaránt tartalmazó lizátummal fertőztük a tenyészetet és feleslegben levő tsA28 vírust adtunk hozzá és 41 °C hőmérsékleten inkubáltuk. 70 órával a fertőzés után a közeget begyűjtöttük a szintetizált HBsAg jellemzése céljából. Emellett intracelluláris kis molekuiasúlyú DNS-t különítettünk el B. J. Hirt módszere (lásd fentebb) szerint. Az elkülönített DNS-t újból szuszpendáltuk 1 ml térfogatú, trisz-kloridot (pH=7,4) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldalban. Ezután 5 ml hasítatlan DNS-t és 5 pl Bum Hí-vei kezelt DNS-t 0,8?/o-os agaráz-gélen, TBE puí'ferben lefolytatott eiekíroforézissel frakcionáltunk; kontrollként SV40 DNS-t kezeltünk ugyanilyen módon. A gélen kapott DNS-képet nitrocellulózpapírra vittük át és a HbsAg gén-minta forrásaként alkalmazott 3-’P-vel jelzett pHS94 DNS-ra hibrídizáltunk [vő.’, E. M. J. Southern: J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)]. A 32P-vel jelzett pHS94 hibridizáció utáni autoradiografikus képet a 7. ábra mutatja. Az „A” és „B" sávok kezeletlen Hirt-féle szupernatáns, illetőleg BamHl-vel kezelt Hirt-féle szuprenatáns DNS képei. Az „I”, „II” és „III” jelek a kontroll SV40 DNS I, I! illetőleg III alakjának a helyzetét mutatják; ezeket a helyzeteket etidiumbromiddal való megfestés útján határoztuk meg, a DNS nitrocellulóz-papírra történt átvitele előtt. A pSVHBSA által kódolt hepatitisz felületi antigén részecske-alakban történő szintézise A fertőzött májsejtek a hepatitisz felületi antigént részecske-alakban szintetizálják és választják ki [vö.: O. Blomberg: Science 197, 19 (1977)]. A különféle klónozott hepatitisz—DNS-ek szekvencia-analízise arra a lehetőségre utal, hogy az érett felületi antigén egy nagyobb molekulájú prekurzor-fehérjéből hasítható 1c jP. Charnay és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, 2222 (1979)]. Minthogy a leírt szerkezeti felépítésű SV40 genom csak érett HBsAg-molekulát kódoló DNS-t tartalmaz, néhány 3'-heiyzetben transzlatálatlan szekvencia mellett, felmerül a kérdés, hogy a feltételezett prekurzor-fehérje játszik-e valamilyen funkcionális szerepet a 22 nm-es részecske szintézise és a szintézis befejezése utáni kiválasztása során. Ezért a szintetizált hepatitisz felületi antigén jellemző tulajdonságait (ülepedési sebesség, ülepedés! egyensúly és elektron-mikroszkópiái analízis) az autentikus fehérjéivel hasonlítottuk össze. Amint a 8. ábrán látható, az általunk alkalmazott vektor-rendszerben szintetizált hepatitisz felületi antigén ülepedési sebessége nem különbözik a fertőzött májsejt-vona! közegéből [J. J. Alexander és munkatársai: S. Afr. Med J. 50, 2124 (1976)] elkülönített hepatitisz felületi antigénétől, úsztatási sűrűsége 1,22 g/cm\ ami szintén hasonló a 22 nm-es részecske-alakú autentikus felületi antigénéhez (vö,: O. Blumberg, i.m.). A tisztított felületi antigén elektron-mikroszkópos vizsgálata is azt mutatta, hogy a szintetizált felületi antigén túlnyomóan részecske-szerkezetű, 220 A (22 nm) átlagos részecske-átmérővel, tehát morfológiailag azonos az autentikus 22 nmc-s részecskékkel (8. és 9. ábra). Ennek alapján megállapítható, hogy az érett hepatitisz felületi antigén fehérje-monomer az egyetlen olyan hepatitisz vírus által kódolt lényeges szerkezeti komponens, amely szükséges a 22 nm-es részecskék felépítéséhez. A) A CV—1 sejtekben szintetizált HBsAg ülepedési sebességének összehasonlítása a PLChepaí mia-sejtvona! [vö.: J. J. Alexander és munkatársai: S. Afr. Med. J. 50, 2124 (1976); P. L. Marion és munkatársai: J. of Virol. 32, 796 (1979)] által szintetizált és kiválasztott HbsAg ülepedési sebességével (8A. ábra): Az e kísérletben alkalmazott HBsAg a 7. ábrán szemléltetett kísérletben kapott kultúra-közegből származott; a PLC sejtvonal által termelt HBsAg-t e sejtvonal kultúra-közegből nyertük. A kétféle kultúra által termelt HBsAg-t ammónium-szulfáttal történő 45%-os telítés útján választottuk le a kultúra-közegekből, majd 20 mmol/1 trisz-kloridot (pH=7,4), 0,5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 0.5 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldatban újra szuszpendáltuk őket 0,5 pg/ml HBsAg végső koncentrációban. Mindegyik mintából 200—200 pl mennyiséget vittünk fel 2—2 párhuzamos kísérletben 5—5 ml ugyanilyen pufferold.ittál készített sacharóz-grádiensre (5—20% szacharóz-tartalommal). A mintákat egy Beckman SW 50.1 rotorban 45000 percenkénti fordulattal 80 percig centrifugáltuk 4°C hőmérsékleten, A HBsAg-tartalom meghatározására egy „Ausria 11—25” (Abbott Laboratories) HBsAg-meghatározó készletet használtunk, A HBsAg-visszanyercs mindkét fajta HBsAg esetében 80% felett volt. B) A CV — 1 sejtekben szintetizált HBsAg ús*tatásos sűrűség-meghatározása (8B. ábra): Az összegyűjtött fertőzött kultúra-közegből ammánium-szulfáttal 45%-ig történő telítés útján lecs ipott 2 jig HBsAg-t agaróz-gél permeációs oszlopon (A 0,5 M, Bio-rad) frakcionáltuk, majd 5—20%-oá szacharóz-gradiensen keresztül ülepítői tíik, az A) bekezdésben leírt módon. A szacharóz-gradiens centrifugáiása után az összegyűjtött HBsAg-t szacharóz nélküli grádiens-pufferrel szemben dializáltuk, azután szilárd cézium-kloridot adtunk hozzá, olyan mennyiségben, hogy a 7 ml térfogatú oldat végső sűrűsége 1,2 g/cm3 légy.-n. Ezután Sorwall T 865.1 rotorban, percenként 50000 fordulattal 68 óra hosszat centrifugáltuk. A meghatározást az A) bekezdésben leírt módon végeztük. A HBsAg visszanyerése a cézium-szulfát gradiensben körülbelül 70% volt. A csúcs-frakciókat azután egyesítettük, 100 mm 1/1 nátrium-kloridot és 0,5 mmoí/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó 10 mml/l-es trisz-klorid pufferoldattal szemben dializáltuk, betöményítettiik cs előkészítettük az elektronmikroszkópiái vizsgálathoz. \z antigén elektronmikroszkópiái viszgálatra való előkészítése céljából szénnel bevont rész-rácsokat készítettünk. A 1 pg/ml HBsAg-fehérjét tartalmazó puffcroldatból egy cseppet vittünk fel egy rácsra cs szobahőmérsékleten 30 percig állni hagytuk. A fehcrjeoldatot sugárirányban felitattuk a rácsról cs 4 csepp vízzel egyszer mostuk. A rácsot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
