196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2 hoztuk létre. A harmadik fragmentet („C” fragment) a következő módon állítottuk elő: j 2. A pHBV—T—1A plazmidbói Hpal enzimmel történő hasítás útján egy a HBsAg gént tartalmazó 1700 bp fragmentet hasítottunk ki. A Hpal helyet a pBR322 plazmid egy előzőleg DNS-polimeráz I Klenow fragmenttel [H. Jacobsen és munkatársai: Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974)] kitöltött EcoRI helyéhez kapcsoltuk. Ezt a pBR322 származékának szubklónozása útján hajtottuk végre és így a pHS42 plazmidot kaptuk. Ezt a plazmidot azután az Xbal enzimmel (amely 31 kódonnál hasít) és a BamHl enzimmel (amely 375 bázis-párt hasít le a pBR322 EcoRI helyéről) hasítottuk, és így a HBsAg gén legnagyobb részét, a HBsAg géntől különálló körülbelül 150 bázispárt, valamint a tetraciklin-rezisztencia-gén első 200 bázis-párját tartalmazó promotor/operátort tartalmazza. Ezt a Vbal és BamHl enzimekkel kötött „C” DNS-fragmentet poliakrilamid-gélen történő frakcionálással különítettük cl cs a fentebb leírt háronifragment-kapcsolásban használtuk fel a pHS94 plazmid előállítására (2. ábra). HBsAg szintetizálására képes rckomhináns SV40 DNS felépítése Annak biztosítására, hogy nagy mennyiségű megfelelően kapcsolt DNS álljon rendelkezésünk,'re majomsejtek transzfekciójához, a kapcsolt 'DNS-t E. coliban klónoztuk a következő módon: A pSVR-ből származó, SV40 DNS-i tartalmazó BamHl EcoRI fragmentet a 3. ábrán szemléltetett módon először a pHS94 plazmidbói származó hepatitisz felületi antigént tartalmazó EcoRI — BamHl fragmenttel kapcsoltuk az EcoRI helyen keresztül, majd az így kapott fragmentet a pBR322 Bam Hl helyébe klónoztuk. A helyesen felépített pSVHBSA DNS azután a BamHl reszt rikció-endonukleázzal hasítható, amikor is a DNS 5382 nukleoíidot tartalmazó fragmentjét kapjuk, ez egy rckomhináns SV40 genomból áll, amelyben a PV - i fehérje kódolási tartománya helyett hepatitisz felületi antigént kódoló gén kódoló tartománya van jelen A pSVHBSA DNS felépítése céljából 0,3 (tg (SY40 DNS-t tartalmazó) DNS-fragmentet a Bam- HI +EcoRI enzimmel kezelt pSVR DNS-ről, 50 ng (pBR322-t tartalmazó) DNS-fragmentet a Sum Hl-vei kezelt pHBV—T— 1A DNS-böl és 0,2 ng(HBsAg-t tartalmazó) DNS-szekvenciát a Bam- HI +EcoRI enzimmel kezelt pHS94 plazmidbói, T4 DNS-ligáz segítségével összekapcsoltunk BamHl, illetőleg EcoRI helyeiken keresztül, 15 ml ligációs elegyben éjjelen át történő inkubáció útján. A helyesen kapcsolt DNS-termékek egyik része a pBR322 egy intakt tetR génjét rekonstruálta és így ez a tetK alapján kiszelektálható a vektor DNS ön-ligációja útján keletkezett nagyszámú tcts rekombináns közül. A pSVHBSA szerkezetét azután resztrikciós enzimmel való kezelés útján igazoltuk. Rekombináns SV40 vírus szaporítása és HbsAg expressziója majomsejtekben A hepatitisz felületi antigén ilyen vektor-rendszerben történő szintézisének hatásosságát oly módon ellenőriztük, hogy a EowHI-vel hasított pSVHBSA DNS-t a DEAE-dextrán módszerrel jJ. H. McCutehan és J. S. Pagano: J. Nat. Cancer lust, 41, 351 (1968)] bevittük CV-1 sejtek egysejtrétegébe [J. E. Mertz és P. Berg: Virology 62, 112 (1974)] és a sejteket vagy tsA28 vagy tsA58 vírussal [P. J. Tcgtmeyer: J. Virology 10, 591 (1972)] fertőztük. A CV —1 egysejt-réteget azután 41 °C hőmérsékleten inkubáltuk megfelelő körülmények között (vö.: J. H. McCutehan és J. S. Pagano, i.m.). A tsA28 és tsA58 egyaránt hőmérsékletre érzékeny mutánsok az SV40T antigénben és ezért 41 °C hőmérsékleten nem képesek szaporodni [vö.: N. J. Acheson: Molecular Biology of Tumor Viruses (szerk. J. Tooze), Cold Spring Harbor Lab., N. Y. 2. kiad., 2. rész, 125—204 old. (1980)]. Hasonlóképpen, a csupán rekombináns SV40 genomot (pSVNBSA) tartalmazó CV—1 sejtek nem termelnek fertőző vírust, mert a pSVHBSA-nak h ányzik a VP —1 gén. Amint várható volt, 4 nap múlva citopátiás hatást észleltünk azonban a CV— 1 sejtekben, amelyek mind a ts SV40 vírust, mind a rekombináns SV40 genomot tartalmazták. Kétheti inkubálás után teljes sejt-lízis volt megfigyelhető. Azokban a CV—1 sejtekben viszont, amelyek csak vagy rekombináns SV40 genomot, vagy ts SV40 vírust kaptak, citopátiás hatást nem tapasztaltunk. Szokásos ipari radioimmunológiai módszert („Austria 11 — 125”, Abbott Laboratories) alkalmaztunk a HbsAg kimutatására. és így azt tapasztaltuk, hogy a DNS bevitele után már 4 nap múlva kimutatható a felületi antigén termelése a kultúra-közegben. A mennyiségi meghatározás azt mutatta, hogy 1,10*’ CV— l sejt egysejt-rétege 3,8 pg-ig menő mennyiségű HbsAg antigént termel az egyes fertőzési ciklusokban, ami sejtenként 9,1()7 molekulának felei meg. Ez a szám csaknem azonos az egy-egy fertőzési ciklusban SV40 VP— 1 fehérje-molekulák becsült számával (vö.: N. H Acheson, i.m.). Annak meghatározása céljából, hogy a rekombináns SV40 genom az SV40 vírushoz hasonlóan a CV—1 sejtekben van-e bezárva és ott szaporodik-e, a CV— 1 sejtek egy rétegét 41 °C hőmérsékleten ts SV40 vírussal és emellett az eredeti együtt fertőzött sejtek lizátumának egy hányadrészével fertőztük. 72 órával a fertőzés után kis molekulasúlyú DNS-t különítettünk el a fertőzött sejtekből, B. I. Hirt [J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967)] módszere szerint. Az elkülönített DNS-t vagy kezeletlenül vagy resztrikciós endonukleázokkal való kezelés után, agarázon történő gél-elektroforézissel frakdonáltuk. A frakciónak DNS-t azután denaturáltuk és nitrocellulóz-papírra vittük át E. M. J. Southern [J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)] módszere szerint, majd 32P-vel jelzett pHS94 DNS-sel kezeltük. Amint a 7. ábrán látható, a hepatitisz génszekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekulák legnagyobbrészt zárt-cirkuláris DNS alakjában vannak jelen, az SV40 vírus-DNS-től megkülönböztethetetlen mérette! („A” sáv). A rekombináns DNS nagyobb része in vivo ligáció útján regenerálja ZJnmHI helyét („B” sáv). Amint várható volt, a hepatitisz—B felületi antigén kódolási tartományát tartalmazó Bam EcoRI fragment (3. ábra) változatlan alakban szintén elkülöníthető. 5 10 7 5 30 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
