196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2 1 IBsAg szerkezeti gcn elkülönítése A fenti módon felépített SV40 vektort a hepatitisz—B vírus felületi antigénjét (HBsAg) kódoló gén expressziójára terveztük. A HBsAg egy 25 000 molekulasúlyú, rendes körülmények között komplex részccskés szerkezetű (22 nm átmérőjű részecskékkel), részlegesen glikozilezett polipeptid, amely a fertőzött májsejt külső felületére választódik ki [O.Blumberg: Science 197, 19 (1977)]. A HBsAg-nek’a fenti módon megszerkesztett SV40 vektorban történő expressziójára alkalmazható és a HBsAg kódoló szekvenciáját tartalmazó ideális DNS-fragmentnek a következő feltételeket kellene kielégítenie: Először, ennek a DNS-nek egy EcoRí resztrikciós helyet kell tartalmaznia az egyik végén, egy Bom Hl helyett pedig a másik végén. Másodszor, az EcoRl helynek közvetlenül 5' re kell elhelyezkednie a HbsAg iniciálé kodonjához képest, úgy, hogy helyreállítható legyen a VP— 1 fehérjében az ATG eredeti helyzete. Végül, a keletkező rekombináns SV40 molekulának hasonló méretűnek kell lennie a vad-típusú SV40 DNS-hez, hogy eredményesen bevihető legyen vírus-részecskékbe. E feltételek kielégítésének biztosítása céljából egy kísérletsorozatot végeztünk, amelynek részleteit a 2. ábra szemlélteti. E szerkezet egyik fontos vonása egy Eco RÍ resztrikciós hely létrehozása közvetlenül 5'-re a HbsAg feltételezett ATG iniciáló kodonjához. Ezt egy szintetikus dATGGAGAACATC dodekámer használata útján értük el; ez a dodekámer az iniciáló kodonnak és a következő 3 aminosavnak megfelelő szekvencia a HbsAg-ban és egy helyzetspecifikus primer az E. coli DNS-polimerázhoz, a DNS-nek egyszálú klónozott HBV DNS-hől történő szintézisére. A szintetikus DNS-t azután, megfelelő enzimes kezelés után összekapcsoltuk a kiónozott HBV DNS-sel egy intakt HBsAg gén helyreállítása céljából cs így egy a végén Eco Rí helyet tartalmazó kezelt vektor DNS-t kaptunk a kívánt Eco Rí hely újbóli helyreállítására. Az így kapott plazmidot pHS94 névvel jelöltük meg. A HBsAg-t kódoló sz< rkezeti gént egy a teljes HBV-genomot tartalmazó és a pBR322 EcoRl helyzetébe klónozott pHBV—T—1A plazmidból nyertük ki. Ezt a kiónt hasonló módszerekkel állítottuk elő, mint amilyeneket P. Valenzuela és munkatársai — Nature 280, 815 (1978) — valamint P. Charnay és munkatársai — Proe. Natl. Acad. Sei. (USA), 76, 2222(1979) — nemrégiben leírtak. Az említett szerkezeti gént kétféle úton módosítottuk: t. abból a célból, hogy bevigyünk egy egyedülálló resztrikciós helyet közvetlenül a kezdeti ATG metionin kodon előtt, és 2. hogy a HbsAg génhez távoleső HBV Hpa 1 helyet tompavégűén kapcsoljuk a pBR322 betöltött EcoRl helyéhez. A HBsAg szerkezeti gént tartalmazó DNS-fragment említett két módosítását az alábbi módon hajtottuk végre. 1. 50 pgpHBV—T—1A DNS-t először 80 egység Hpa 11 enzimmel kezeltünk 200 pl térfogatú, az enzim szállítója (BRL) által megadott összetételű reakeióelegyben, az ugyancsak a szállító által megadott reakciókörülmények között és így egy 1,7 kb. DNS-fragmentet kaptunk, amelyben a HBsAg kódoló szekvenciáinak iniciáló kodonja szorosan az irány-szál (sense-strand) 5'-végének közelében körülbelül 400 bp) helyezkedett el. A DNS-t poliakrilamid-gélen végzett elektroforézissel tisztítottuk. A tisztított Hpall fragmentet ezután 2 egység lambda-exonukleázzal kezeltük 100 ,ul reakeióelegyben (a New England Biolab cég készítménye) 30 percig 37 °C hőmérsékleten. A lambda-exonukleáz egy a kétszálű DNS enzimes hasítására alkalmas 5'-exonukleáz. Ez a hasítási reakció lebontja a „sense-strand” DNS 5'-felét a HBsAg-kódoló szekvenciákról és szabaddá teszi az ellenértetmű szálat (antisense strand) a hozzáadott primerrcl való párosításra. A lambda-exonuklcázzal kezelt DNS-t fehérjementesítettük és újból szuszpendáltuk egy 50 pl térfogatú, 40 mmol/l kálium-foszfát puffert (pH=7,4) 1 mmol/l DTT-t, 50 pg/mi BSA-t, 6 mmol/l magnézium-kloridot, 0.5 mmol/l mindegyik fajta dNTP-t és 0,2 n mól dATGGAGAACATC-t (az 5'-\égen '’P-jclzctt. polinukelotid kináz segítségével) tartalmazó reakeióelegyben. Az elegyet először 1 percig 90°C hőmérsékleten tartottuk, majd hirtelen lehűtöftük 0°C-ra és 30 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, azután pedig 3 óra hoszszat inkubáltuk 2 egység E. coli DNS-polimeráz 1 Klenow-fragmení (H. Jacobsen és munkatársai: Eur J. Biochem. 45, 625 (1974)] jelenlétében. A DNS-polimeráz a hozzáadott primer által iniciált DNS-t és 3'—OH végeket tartalmazó, lebontott, egyszálú DNS-t szintetizál és így tompavégű DNS-molekulákat hoz létre. A kapott DNS-t azután mentesítettük a fehérjéktől, 45 egység Xba I enzimmel 100 pl reakeióelegyben történő kezelés útján hasítottuk egy a HbsAg génen belüli helyen és vígül poliakrilamid-gélen frakcionáltuk. így egy 91 bázis-páros, a HbsAg gén első 30 kodonját tartalmazó DNS-fragmentet különítettünk el autoradiografikus detekció után („A” fragment). Egy egyedülálló resztrikció-helynek közvetlenül a H£<sAg géntől 5'-re történő létesítése céljából a pBR322 plaztnid egy pNCV elnevezésű származékát [Goedde! etc.. Nature287, 413 (1980)} használtuk fel, amely az A ATT CTG C AG GACGTCITAA szekvenciája szintetikus DNS-szegmentet tartalmazza az EcoRl helyen. Egy Pstl hely is be van iktat* a ebbe a szintetikus DNS-szekvenciába. Először 10 pg pNCV DNS-t hasítottunk 24 egység Pstl enzimmel 100 pl reakeióelegyben, majd 2 egység E. coli DNS-polimerázKlenowfragmentíel kezeltük 50 pl reakeióelegyben a fentebb leírt módon, 1 óra hosszat 8°C hőmérsékleten. A DNS-polimcrázzal való kezeléssel a Pstl enzimes kezelés által létrehozott 4 bázis-páros 3'-nyúlványt távolítottuk el, majd őnmHl-vel hasítottunk, s így egy érintetlen EcoRl resztrikció-helyet tartalmazó tompavégű DNS maradt vissza „B” fragmentként, amely tartalmazta a pBR322 replikácíójának kezdőpontjait. A fentebb leírt módon előállított tompavégű „A" HbsAg gén-fragmentet ezután kapcsoltuk a „B” fragment EcoRl helyéhez. tzt a műveletet egy háromfragment-kapcsolással hajtottuk végre és így a pHS94 plazmidot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
