196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2 ,ját, úgy hogy a szándékolt poiipepíid-termékek szabályozott környezetben, nagy hozammal legyeinek elérhetők. B) Sejtkultúra-technológia A genetikai és sejtfiziológiai tanulmányokra alkalmas sejt- és szövetkultúrák előállítási és alkalmazási módja jól ismert. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek különálló normális sejtek ből folytatólagos sorozatos átvitel útján előállított állandó sejtvonalak fenntartására. Az ilyen sejtvonalak a kutatási munkában való felhasználás céljára vagy valamely folyékony közegben tartott szilárd hordozón, vagy pedig tápanyagokat tartalmazó szuszpenzióban való tenyésztés útján tartják fenn. A nagy méretekben történő termelés céljából való felnagyítás csupán mechanikai problémákkal jár. A technikai háttér további részleteire vonatkozólag vö.: Microbiology, 2. kiadás. Harper and Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland (1973), különösen 1122. és köv. old., valamint Scientific American 245, 66. és köv. old. (1981). A találmány leírása i A találmány a hepatitisz—B vírus (HBV) immu'nogenotikus determinánsait tartalmazó hepatitisz— B felületi antigén (HBsAg) gerincesállat-scjíkultúrárában történő előállítására [szolgáló eszközökre és ’módszerekre] vonatkozik. Az így termelt HBsAg különálló szemcsék alakjában választódik ki a kultúra közegbe, mentesen mindenfajta akár a HBV-genom más része által, akár az alkalmazott vektorral homológ DNS által bekódolt kísérő vagy hozzákötött mesterséges poüpeptidtöl. Az így termelt HBsAg a találmány értelmében oly vakcinák előállítására alkalmazható, amelyek immunogenicitást biztosítanak HBV ellen az ilyen fertőzésre érzékeny embereknek. A találmány körébe tartozik az eljárás is ilyen vakcinák előállítására, valamint azoknak a fertőzéssel szemben érzékeny emberek HBV elleni immunizálást nyújtó beoltására történő alkalmazására is. Hepatitisz—B vírus A hepatitisz—B (szérum-hepatitisz) vírus emberről-emberre vivődik át és a fertőzött személyt krónikusan legyengítő fertőzésben nyilvánul meg. amely progrediálva súlyos májkárosodást, primer karcinomát és halált is eredményezhet. A legtöbb esetben ugyan a hepatitisz—B fertőzésekből való teljes felgyógyulás várható, azonban — különösen számos afrikai és ázsiai országban — a népesség széles rétegei a fertőzés krónikus hordozói, ami a betegség széles körű. pandemias terjesztésének veszélyét hordozza magában. A hepatitiszt egy vírus-vektor (hepatitisz—B vírus, HBV) okozza, amely teljes állapotában — az úgynevezett Dane-részecske — a viriont képviseli és egy DNS-moiekulát magába záró, 27 nm méretű nukleokapszidból és a nukleokapszidot körülvevő burokból áll. A virionnal társuló fehérjék közé a mag-antigén (HBcAg), egy DNS-polimeráz és a fertőzött vagy fertőzést hordozó emberek szérumában talált felületi antigén (HBsAg) tartozik. Úgy vélik, hogy a HbsAg az a HBV-antigen, amely kiváltja az immunogén antitest (anti — HBs) termelést és így ez lenne a fő alkotórész egy HBV-vakcinában. Az e tárgyra vonatkozó irodalomból különösen Dane és munkatársai Lancet, 1970 (1), 695 (1970); Hollinger és munkatársai; J. Immunology 107, 1099 (1971); Ling és munkatársai; .1. Immunology 109, 834 (1972); Blumberg: Science 197, 17 (1977); peterson és munkatársai: (Proc. Nail. Acad. Sei. USA, 74, 1530 (1977); Viral Hepatitis, A Contemporary Assessment of Etiology, Epidemiology, Pathogenesis and Prevention (Vyas és munkatársai, kiadók), Franklin Insitute Press, Philadelphia, 1978, érdemelnek figyelmet; a felsorolt közlemények tartalma hozzátartozik a jelen találmány hátterét képező technika e leírásban történt ismertetéséhez. A EIBsAg a fertőzött plazmában túlnyomórészt körülbelül 16—"5 nm átmérőjű gömbalakú részecskék — úgynevezett „22 nm es részecskék” — alakjában van jelen. Ezek a jelenlegi felfogás szerint egy nem-fertőző virális burkot képviselnek. Minthogy a HBsAg elleni antitestek védelmet nyújtanak a HBV-fertőzésse! szemben, ezek a nem-fertőző részecskék hatásosan alkalmazhatók vakcinaként. Minthogy a hepatitisz—B vírus nem volt fertőzőképes a sejtkultúrákban és csupán fertőzött emberekből vagy magasabbrendű emberszabású majmokból nyerhető, nem álltak rendelkezésre oly eszközök vagy módszerek, amelyek segítségével elegendő mennyiségű HBV lett volna nyerhető és fenntartható a HBV ellen immunizáló antigén termelésének céljaira. A technika jelenlegi állása A 2 034 323A sz. nagy-britanniai közrebocsátás! irat, valamint a 13 828 és 20 251 európai szabadalmi közrebocsátási irat ismerteti a HBV genom elkülönítését és klónozását, a HBV mag-antigén expressziéiül. valamint a HBsAg egy részét állítólag tartalmazó fúziós fehérjének E. coli mikroorganizmusban történő termelését. A Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77, 4549 (1980) közlemény beszámol egér-kromoszómának egér-sejtek tandem-klónozott hepatitisz-B gcnomokkal történt transzformációja ólján lefolytatott integrációjáról. Moriarty és munkatársai —- Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78, 2606 (1981) leírják egy HBV—DNS fragmentet hordozó rckombináns majom 40—vírus (SV40) felépítését. A majomvesc-sejtkuilúrákat a virális rekombinánssai fertőzték és így egy olyan 22 nm-cs részecskét hoztak létre, amely állítólag jellemző a hepatitisz—B-vel fertőzött betegek szérumában talált részecskékre. A Moriarty és munkatársai által alkalmazott rckombináns vektor tartalmazta a HBsAg szekvenciát magában hordozó HBV genomnak egy nagy szegmentjét, tartalmazott továbbá az SV40 tumoi-fehérjéket és esetleg más HBV-fehérjéket kódoló DNS-szekvenciákat is. Emellett szerkezetük magában foglalta a HBsAg—DNS-t az SV40 vírus szekvenciáját kódoló VP—2 fehérje keretében. Nem világos a közleményből, hogy érett HBsAg exprimálása is történt-e. g 10 15 2C 25 30 35 41 45 50 55 (0 65 3
