196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
A rajzok rövid ismertetése Az 1. ábra egy SV40 DNS-t tartalmazó pSVR plazmid szerkezetét ábrázolja, a VP—1 fehérjét kódoló tartomány elhagyásával. A 2. ábra egy HbsAg DNS-t magába foglaló pHS94 plazmid szerkezetét ábrázolja. A 3. ábra egy HVsAg DNS-t és SV40-ből és pBR322-ből származó DNS-szekvenciákat tartalmazó pSVHBSA plazmid szerkezetét ábrázolja. A B-részben a VP— 1 fehérje ATG-iniciáló kodonját (a felső sorban bekeretezve) körülvevő DNS- szekvenciát összehasonlítjuk a rekombinánsban létrehozott HbsAg szekvenciájával (bekeretezett ATG az alsó sorban). Az EcoRI hellyé átalakított Hind III hely alá van húzva. A 4. ábra plazmid-DNS majom-sejtekben történő replikációját ábrázolja. Cos-scjtek egysejtes rétegét tenyésztettük 6 cm-es műanyag-edényekben, 50—60%-os egybefolyásig. A sejteket Dulbecco-féle módosított közeggel mostuk, majd 2 ml 1 pg plazmid DNS-t és 200 pg DEAE-extránt tartalmazó közeggel kezeltük őket 37°C hőmérsékleten 12 óra hosszat. A DNS-oklatot azután eltávolítottuk, a sejteket ugyanazzal a közeggel egyszer mostuk, majd 10% magzati borjú-szérumot tartalmazó közeget adtunk a sejtekhez és 37 °C hőmérsékleten 1, illetőleg 3 napig inkubáltattuk őket a DNS extrakciója előtt. Ekkor kisméretű szuper-tekercseit plazmid—DNS-t különítettünk el Hirt — J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967) — módszere szerint. A kapott DNS-t agaróz-gél elektroforézisnek vetettük alá, majd nitrocellulózra vittük át. vö.: E. M. J. Southern, J. Mól. Bioi. 68, 503 (1975). A replikálódó plazmidok láthatóvá tétele céljából a nitrocellulóz-szűrőt J-P-vel jelzett HBV DNS-sel kezeltük. Az „a” jelzésű sávok a pRI — Bgl-lel transzficiált sejtek Hirt-féle lizátumaiból kapott DNS-t szemléltetik; a „b" jelzésű sávok a pBs34S—L-le! transzficiált sejtek Hirt-féle lizátumaiból kapott DNS képed az „M” jelzésű sáv 1 ug pHBs348—L DNS-t szemléltet. A nyilak a zárt cirkuláris DNS (1), illető'eg a nyílt cirkuláris DNS (11) helyét mutatják. Az 5. ábra a Cos-scjtek >en rekombináns plazmidok által szintetizált HBsAg mennyiségeit mutatják. A Cos-sejtek egysejt-rétegeit körülbelül 50% - os összefolyásig tenyésztettük 6 cm-es műanyagtálkákban. majd a 4. ábrán ábrázolt módon előkészítettük őket DNS-transzfekcióra. 2 ml módosított, 10% magzati borjú szérumot tartalmazó Dulbecco-féle közeget adtunk a tenyészetekhez a transzfekciót követően és a közeget 24 órai akkumuláció után különböző időpontokban vizsgáltuk HbsAg-expresszióra. A HBsAg-expresszió mértéket a 0,2 ml hígítatlan közegben kapott percenkénti expresszió-számban (eps, sount per minute) fejeztük ki, a RÍA (Abbott Laboratories) meghatározási módszere szerint. A 6. ábra a majom-sejtekből származó HbsAg immunogenitásáí ábrázolja. A 20 darab, egyenként 15 cm-es tálban tenyésztett, pHBs348—L-lcl transzfektált Cos-sejtekről kapott közeget és a HbsAg-t ugyanolyan módon tisztítottuk, amint ezt fentebb, az elektronmikroszkópos vizsgálat céljára történt tisztítás esetében leírtuk. Három, egyenként 5—5 egérből álló csoport állatait 2,8 pg. ■0,6.ug,.illetőleg 0,f)f)frpg tiszíítgtt.l^sAg .télies. Plfttnd-íélf 4tdjuv4nsMenlétébeo tör^pó beazíjfcaC Útján imnyunizáUuk'. kontroli-egerek .immunizes- ; sára hasonló mennyiségű autentikus, humáoszé- - rumból származó HBsAg-t (Nortli Ainerican logical.» íné)- alkalmaztunk. A/t egereiét az itfiflik-' • «jutási követően különböző időpontokban vér^ztettük a farkukon; a RIA (Abbott Laboratories) *■ útján meghatározott anti = HBsAg antitest-tanúimat az egerenkénti átlagos titer alapján fejeztük^ ki A szövetkultúrából kapott HBsAg-velimiöuni- " záá egerek azonos titert mutattak, mipt a humán szérumból származó HbsAg-vel immunizált éger re k. A 7. ábra az SV40 részeként replikálódó HBS-. szekvenciák jelenlétét igazolja • A 8A. ábra a rekombináns vektora útján szintetizált HBsAg szacharózgrádiens ülepedését szemlélteti. A 8B. ábra ugyanennek a megfelelő CsClgrádieas centrifugálását mutalja. \ 9. ábra a találmány szerint, 22 nm-es részecskeként szintetizált HBsAgelektron-mikrogramnija. Sejtkultúra-rendszerek — sejtkulíúra-vektorok Az emlősállat-sejtek kultúrában történő szaporítása (szövctkultúra) az utóbbi években rutin^eljárássá fejlődött (vö.: Tissue Culture, Academic Press, szerkesztők: Kruse és Patterson, 1973). Itt a majomvese-fibroblasztok CV—1 vonalát alkalmaztuk gazdasejtként HBsAg termelésére. Az itt részletesen ismertetett kísérleteket azonban le lehetne folytatni bármely olyan sejtvonallal, amely képes valamilyen kompatibilis vektor replikáctójára és expressziójára, tehát például a WI38, BHK, 3T3, CHO, VERŐ vagy HELA sejtvonalakkal. További követelmény az ilyen expressziós vektorral szemben, hogy legyen egy replikáció-kezdópontjn és egy promotorja az exprimálandó génnel szemben és vele egy leolvasó-fázisban, a szükséges riboszóma-kötési helyekkel, RNS-hasítási helyekkel, poliadenilezési hellyel és transzkripcionális terminátor-szekvenciákkal együtt. Bár a leírt kísérletekben az SV40 említett lényeges elemeit hasznosítottuk és a találmányt ennek az előnyös kiviteli módnak az alapján ismertetjük, meg kell jegyezni, hogy a találmány nincs ezeknek a szekvenciáknak az alkalmazására korlátozva. így például felhasználható valamely más vírus (például Polyma, Adeno, Retro, VSV, BPV stb.) vektorainak replikáció-kezdőpontja, valamint a DNS-repíiknció celluláris kezdőpontja is, amelyek nem-integi'áli állapotban működhetnének. Emellett az SV40 DNS repíikációjá egy egyedülálló helyen kezdődik és két irányban halad előre [vö.: J. Tooze (szerkesztő): DNS Tumor Viruses, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Lab., New York, 1980j. A genetikai bizonyítékok arra mutatnak, hogy csupán egyetlen vírus-gén termék szükséges a vírus-DNS replikációjához. Ez az A-gén terméke (T-antigén), amely szükséges ahhoz, hogy iniciálja a vtus-DNS szintézisének minden egyes ciklusát |yö : P. J. Tegtmcyer; J. Virology 10, 591 (1972)). Az itt leírt kísérletek azt bizonyították, hogy az SV40 DNS-rcplikációjánaJk kezdőpontját tartalmazó rekombináns plazmidok majomsejtekben, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
