196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 talmazó cézium-kloridra rétegezzük és 18 órán át 37000 percenkénti fordulattal 15 °C hőmérsékleten centrifugáljuk Beckman ultracentrifugában SW 50. 1 rotorban (Beckman Instrument Co., Fullerton, California). A ribonukleinsav a cenlrifugacső aljára kerül. A hírvivő ribonukleinsav további tisztítását oligo-dT-cellulóz oszlopon végezzük lényegében Ullrich és munkatársai (lásd előbb!) és Secburg és munkatársai (lásd előbír!) módszere szerint. A részlegesen tisztított hírvivő ribonukleinsavbiológiai aktivitását sejtmentes fehérje-szintézis rendszerben vizsgáljuk búzacsírában, oly módon, hogy meghatározzuk az S^-metinonon beépülést a növekedési hormonba. A vizsgálat kísérleti körülményeit Martial és munkatársai (Prod. Nat. Acad. Sei, USA, 74, 1816—1977) írják le. Az 1. ábrán bemutatjuk egy ilyen vizsgálat eredményét. A radioaktívan jelzett fehérjét génelekíroforézisscl frakcionáljuk, az elektroforézist 12,5% poliakril-amid gélen végezzük, amely 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmaz. Az elcktroíorézis 4 órán 20 m.A áramerősség mellett folyik. A radioaktívan jelzett fehérjecsíkot autoradiográfiával mutatjuk ki. Az a csík a T4 bakteriofágból származó CN-jelzett marker-fehérjcl jelzi. Az 1 —6 számú csíkok az egyedi tumorokból izolált hírvivő ribonukleinsav oligo-dT-cellulózcs tisztítást követő transzlációs termékeit jelzik. Látható, hogy az 1—5 tumorok esetén a sejtmentes körülmények között kapott szintetikus termék nagy része a növekedési elóhormon. A sejtmentes rendszerben mért növekedési előhormon transzlációs aktivitásban gazdag RNS készítményeket (a 2, 4 és 5 csíkokat értjük ez alatt), összegyűjtjük és templátként használjuk a kétszálú cDNS szintéziséhez. Az összes reakciólépést 1,5 ml térfogatú műanyag ccntrifugacsőbcn végezzük. Az elsó reverz transzkriptáz enzim által katalizált reakció után RNS—DNS hibridet kapunk, a reakciót az alábbi összetételű rcakcióelegyben végezzük: 68 pl, közelítőleg 13 pg RNS-t tartalmazó ribonukleinsav készítmény, madár mieloblasztózist okozó vírus reverz transzkriptázzal, ezt4 pl nem hígított készítményként adagoljuk (a készítményt az alábbi forrásból szereztük be: Office of Program Resources and Logistics, Viral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause and Prevention, National Cancer Insttitute, Bethesda, Maryland), 32 pl reakcióelegy 10 pi reverz transzkriptáz-puffert tartalmaz (ennek összetétele, 0,5 mól trisz-hidrogén-klorid, Ph 8,3; 1 mM EDTA, 70 mM magnézium-klorid, 200 mM kálium-kforid), 1 pi 1 mólos 2-merkaptoetanol, 5pl 1 pg/ml oligo-dT-t tartalmazó oldat, 5 pl, egyenként 20 mM-os oldatból adagolt dATP, dGTP és TTP, 1 pl 20 mM-os dCTP és körülbelül 2x 106 cpm a-(P3-)-dCTP, amit közvetlenül a reakcióelegyben oldunk. A reakciót lényegében Seeburg és munkatársai (lásd előbb) szerint végezzük. Az indukált reakcióelegyet kloroformmal telített fenollal extraháljuk ugyanabban a centrifugacsőben, etanollal kicsapjuk a terméket és legalább 15 percen át —70°C hőmérsékleten tároljuk a csövet, amiután centrifugáljuk. A kicsapott RNS—DNS hibridet 0, l n nátriumhidroxid, 125 pl 5 mM-os EDTA elegyében oldjuk és 68 °C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk az RNS szelektív alkalikus hidrolízisére. Ezután Pasteur-pipettába töltött Sephadex G—50 (kereskedelmi név Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) gyantából készült kis oszlopra töltjük, a terméket 10 mM-os, 7,5 pH-jú, 0,5 mM EDTA-t tartalmazó, triszpuferall eluáljuk. A raiokatív jelzett egyszálú dezoxiribonukleinsavat Eppendorf-csóben felfogott két cseppből álló frakció tartalmazza. Lezárjuk a frakciószedó csöveket, szt intillációs tokokba helyezzük és folyadék szcintilíáciős számlálóba helyezzük a Cerenkov-sugárzá'i mérésére. A fenti reakciólépésbő! származó egyszálú cDNS termékből kiinduló kétszálú cDNS molekula szintézisét reverz transzkriptáz enzimmel katalizált reakcióval végezzük. A reakciót 51 pl össztnrfogatú alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük: 30 pl egyszálú dezoxiribonukleinsav oldat, 3 5 pl enzimoldat; 17,5 pl reakcióelegy az alábbi összetevőkből áll: víz 96 pl; reverz transzkriptáz puffer 60.pl; 1 mólos 2-merkapto-etanol oldat 6 pl; 20 mM-os dATP oldal 15 pl; 20 mM-os dGTP oldat 15 pl; 20 mM-os TTP oldat 15 pl; 20 mM-os dCTP oldat 3 pl; továbbá közelítőleg 6x10s percenkénti beütést adó a-fP-^-dCTP oldat, amit közvetlenül a reakcióelegyben oldunk. 50 percen át 47 C hőmérsékleten folyik a reakció. Ezután leállítjuk és a fehérjét extrakcióval elkülönítjük és az oldatot Sephadex G—50 gyantából készült oszlopon kromntografáljuk az előzőekben megadott módon. Ezt követően az előzőekben megadott módon etanolos kicsapást végzünk. Annak bizonyítására, hogy a növekedési hormont meghatározó cDNS-ben a készítmény gazdag, restrikciós endonukleázokkal hasítjuk a két( szálú cDNS készítmény egy részét és 4,5% poliakil-amid gélelektroforézissel analizáljuk (lásd a 2. tbrát). A 2. ábra c és k betűvel jelzett csíkjai a radioaktívan jelzett bakteriofágból származó fd Jezoxiribonuklcinsavból származnak, amelyek a c esetén Hpafl enzimmel és a k esetén HaeliI enzimmel hasítottunk. Az a és b csíkok a nem hasított kétszálú cDNS csíkjának felelnek meg. A d-j csíkok az alábbi enzimekkel hasított dezoxiribonukleinsav fragmenseknek felelnek meg: d: Pstl+BglII; e:PvuII; f:PvuIl+BglII; g:HinflI+S- mal, Iv.Haelll; i:PvuII végülj: HaeliI. A megfigyelt csíkok megfelelnek a humán növekedési hormon hírvivő ribonukleinsavával komplementer cDNS molekulának, mivel megfelelnek az előzőleg klónozott humán növekedési hormont meghatározó 550 bázispárból álló fragmensnek (lásd: 897 710 számú leírást). Ezek az adatok alátámasztják azt a tényt, hogy a túlsúlyban jelenlévő cDNS valóban komplementer a humán növekedési hormont meghatározó hírvivő ribonukleinsavra. A fentiek szerint előállított kétszálú cDNS molekulát lényegében Ullrich és munkatársai (lásd előbb), módszere szerint eljárva SÍ nukleázzal kezeljük abból a célból, hogy a megfelelő bázisokkal nem páros úgynevezett „hairpin” fragmensszakaszokat hasítsuk. Az enzimes kezelést, ahogy az előzőekben is, extrakció, kromatográfia és kicsapás követi. A megfelelő páros szálat nem tartalmazó végeket dezoxiribonukleinsav-polímeráz I enzimmel katalizált reakcióval teljessé tesszük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
