196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 A reakcióelegy az alábbi komponensekből áll: össztérfogat 20 pl; 60 mM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,5; 8 mM magnézium-klorid; 10 mM 2-merkapto-etanol, 1 mM ATP, 200 pM dATP, dTTP, dGTP, illetve dCTP. A reakcióelegyet egy egység ;E. coli dezoxiribonukleinsav-polimeráz l enzimeméi kezeljük (Boehringer—Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) 10°C hőmérsékleten 10 percen át, amikor az exonukleáz lehasítja a 3'-hibás végeket és az 5'-megfelelő végeket pedig komplementer szekvenciákkal tölti fel. A reakció célja olyan cDNS molekulák ellőállítása, amelyek végei úgynevezett „blunt” végek. A „blunt” végligációval a cDNS molekula végeihez HindlII restrikciós enzim által felismerhető szekvenciákat adunk, a reakciót Seeburg és munkatársai (lásd előbb) módszere szerint dezoxiribonukleinsav-ligáz enzimmel végezzük. Vektorként a pBR322 plazmidot választjuk (lásd: Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95, 1977), az előzőekben megadottak miatt. A beépítést és a szűrési technikákat Ullrich és munkatársai (lásd előbb) szerint végezzük, HindlII, majd DNS ligáz enzimeket alkalmazva. Az ampicillin rezisztens telepeket kiválasztjuk és ampicillint és tetraciklint tartalmazó lemezekre replikázzuk. Az ampicillinre rezisztens, de a tetraciklinre érzékeny telepeket további tanulmányozásra kiválasztjuk. ( A fentiek szerint kiválasztott transzformált sejtekből álló egyes telepekből izoláljuk a plazinid dezoxiribonukleinsavat, ezt HindlII enzimmel kezeljük és elektroforézissel vizsgáljuk a defektiv beépüléseket, köztük a deléciókat és a dupükációkat. A hibás beépüléseket könnyen kimutathatjuk a HindlII fragmensek nagyságának vizsgálatával. A transzfer vektort HindlII enzimmel emésztjük, majd PvuII és BglIII restrikciós enzimekkel kezeljük, és vizsgáljuk a felszabaduló fragmenseket abból a célból, hogy megállapítsuk, hogy a kiónozott dezoxiribonukleinsav meghatározza-e a humán előnövekedési hormont. A kiszabadított cDNS-t a restrikciós fragmenseket gélelektroforézissel frakcionáljuk a dezoxiribonukleinsavat etidium-bromidos fluoreszencia festéssel mutatjuk ki. Az eredményeket a 3. ábrán adjuk meg, az ábrán a nagyobb dezoxiribonukleinsav fragmensek a felső részen helyezkednek el. Az a csík az előzőleg klónozott 550 bázispárból álló humán növekedési hormon dezoxiribonukleinsav (lásd 897710 számú leírást). A b csík a 800 bázispárból álló humán növekedési előhormon teljes dezoxiribonukleinsava. A c és e csíkok sorrendben a PvuII és BglII restrikciós enzimekkel hasított 500 bázispárból álló fragmens mintái. A d és f csíkok mutatják a 800 bázispárból álló teljes előnövekedési hormon dezoxiribonukleinsavat sorrendben PvuII és BglII enzimekkel való kezelést követően. A PvuII enzimmel való hasítás mindkét esetben azonos nagyságú fragmenseket eredményez, ami adódik abból, hogy a PvuII hely az 500 bázispárból álló fragmens egyik végéhez közel helyezkedik el. A BglII enzimmel való hasítás után nagyobb fragmenseket kapunk a 800 bázispárból dezoxiribonukleinsav esetén, mint az 550 bázispárból álló' fragmens esetén, ahogy az várható is. Ezek az eredmények megegyeznek a humán növekedési hormon génjének megfelelő klónozott 800 bázispárból álló hormon génjének megfelelő klónozott 800 bázispárból álló fragmessel. A cHGH800 jellel jelzett klónozott dezoxiribonukleinsavat választottuk ki a szekvencia analízishez. 2. pc!da A cHGHSOO nukleotid sorrendjének analízise. A cHGHSOO nukleotid sorrendjét Maxam és Gilbert módszerével (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 560, 1977) és Sanger és munkatársai módszerével (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 5463, 1977) határoztuk meg. Az eredményt a 4. táblázatban adjuk meg. A klónozott gén a humán pre-növekedési hormont kódoló teljes szekvenciát tartalmazza a feltételezhetően nem átírt és az 5'-végen clhelyezkedő 29 bázispárbó! álló szakasszal együtt, továbbá a nem átírt és a 3'-végen elhelyezkedő 108 bázispárt (kivéve a poli —A szakaszt). (Az 5'- és a 3'-végckct a cDNS azonos szálára vonatkoztatjuk, amely megfelel a növekedési hormon hírvivő ribonukleinsaván lévő szekvenciának). Bizonyos bizonytalanságok fennállnak a növekedési hormon szekvenciájának kezdetéhez közel eső előszekvenciában. Megjegyezzük, hogy a 4. táblázatban megadott nukleotid-szekvencia a növekedési hormon közölt szekvenciájától kismértékben különböző aminosav-szekvenciát határoz meg. Úgy véljük, hogy a nukleotid-szekvencia analízisből következő aminosav-szekvencia valószínűleg a helyes sorrend. Az eltérések olyan kitüntetett aminosavpárok között mutatkozik, mint a glutamin és a glutaminsav, amelyek közvetlen aminosav-szekvencia analízissel kevésbé különböztethetők meg, mint nukleotid-szekvencia analízissel. Ezen felül a nukleotid-szekvencia analízissel előzőleg ismeretlen információkat kapunk, például a növekedési hormon preszekvenciájának valószínű aminosav-szekvenciáját. Az alábbiakban ismertetjük a cHGHSOO transzlációját. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
