196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 (lásd: Roberts, Crit. Rev. Biochem., 4, 123, 1976). A restrikciós helyek viszonylag ritkák, ugyanakkor a restrikciós endonukieázok általános felhasználását nagyban elősegítik restrikciós helynek megfelelő szekvenciájú kettős szálú oligonukleotidok kémiai szintézise. Ily módon gyakorlatilag bármely dezoxiribonuklcinsav szakasz hozzákapcsolható más dezoxiribonuklcinsav szegmenshez, egyszerűen oly módon, hogy a molekula végéhez hozzákapcsoljuk a megfelelő restrikciós oliginukleotidot, majd ezt követően a kapott molekulát a megfelelő restrikciós endonukleázzal hidrolizáljuk, ily módon megkapjuk a megfelelő kohézív végeket (lásd. Heyneker és munkatársai, Nature, 263, 748, 1976 és Scheller és munkatársai, Science, 196, 177, 1977). A restrikciós endonukieázok által felismerhető helyek eloszlásának fontos tulajdonsága az a tény, hogy nem szabályosan helyezkednek el. Ily módon a restrikciós endonukleázzal végzett hasítás történhet szomszédos kodonok között, vagy egy adott kodonon belül. Rendelkezésünkre állnak általánosabb módszerek is a dezoxiribonuklcinsav hasítására vagy a molekula végein lévő bázis sorrend módosítására. Több nem specifikusan ható endonukleázt használhatunk a dezoxiribonuklcinsav molekula nem szabályosan ismétlődő helyeken való hasítására, ahogy azt a későbbiekben ismertetjük. A molekula [végein lévő bázisok sorrendjét oly módon módosíthatjuk, hogy az egyik végen adeninbői álló oligonukleotid „farkat” és a másik végen timinbői álló „farkat” hozunk létre, vagy guartinból, illetve citozinból álló végeket állítunk elő, amivel anélkül kaphatunk restrikciós szakaszokat, hogy e molekulában specifikus szekvenciák léteznének. A végeket természetesen összekötjük. A „kifejeződés” fogalmat annak a ténynek felismerése kapcsán használjuk, hogy egy sejt ritkán, vagy soha nem használja fel egy adott időben az összes genetikai információját. Meg a viszonylag egyszerű szervezetek, mint például a baktériumok sem szintetizálják az összes szintézisre képes fehérjéjüket, bár megfelelő környezeti feltételek mellett ezek szintézise megtörténhet. Ha egy adott gén információja szerinti fehérjét a sejt szintetizál, úgy ez a gén kifejeződik. Ha az adott proteint a sejl nem készíti cl, úgy a kifejeződés nem történik meg. Közönséges körülmények között az E. coli génjeinek kifejeződése, ahogy azt általánosságban az alábbiakban ismertetjük, oly módon történik meg, hogy az adott környezeti feltételek mellett nem szükséges proteinek nem szintetizálődnak cs az anyagcsere által felszabadult energia konzerválódik. Jól ismert az E. coli gén kifejeződésének szabályozása, mivel ezt az utóbbi húsz évben kiterjedten tanulmányozták. Erre vonatkozóan lásd. Hayes, The Genetics of Bacteria and Their Viruses, 2. Kiadás, John Wiley és Sons, Inc., New York, 1968; továbbá Watson, The Molecular Biology of the Gene, 3. Kiadás. Benjamin, Menlo Park, California, 1976. A vizsgálatok szerint több gén. általában a sejtben kapcsolt funkciókat ellátó fehérjéket kódoló gének egy helyen helyezkednek el folyamatos sorrendben. A gének ezen egyheiyű elhelyezkedését operonnak hívjuk. Az operonban lévő összes gén hasonló irányban íródik le, a leírás az első fehérje N-terminális aminosavát meghatározó kodonnal kezdődik és folytatódik az operon által meghatározott utolsó fehérje C-terminális aminosaváig. Az operon elején az N-terminális aminosavat meghatározó kodon előtt szabályozó szakasznak nevezett dezoxiribonuklcinsav szakasz létezik, ez több szabályozó elemet tartalmaz, köztük az operátort, a promotert és a riboszomális kötőhelyek bázisait. Ezen szakaszok funkciója az, hogy a szabályozásuk alatt álló gének kifejeződését lehetővé tegyék oly módon, ahogy erre a sejtnek szüksége van. így például a laktóz felhasználását lehetővé levő enzimek génjei kimutathatóan általiban nincsenek kifejezve laktóz hiányában, vagy i laktóz analóg vegyületének jelenléte nélkül. \ szabályozó szakasznak jelen kell lennie ahhoz, hogy a kifejeződés megtörténjen, elkezdődjön ti transzkripció (átírás) és a transzláció (átfordítás). A sorrendben első gén kifejeződése az operon állal meghatározott első protein N-terminális aminosavának transzkripciójával és transzlációjával kezdődik. Ezután az ettől a ponttól következő összes gén kifejeződése megkezdődik, és ez tart mindaddig, míg egy terminációs (stop) jel vagy egy másik operon következik, amelynek saját szabályozó szakasza van. Mindezt a környezeti feltételek befolyásolják. Bár számtalan variáció ismeretes, a fenti általános séma részleteiben, a legfontosabb tény az, hogy egy prokariota (például az E. coli) génjeinek kifejeződésére a géneknek a transz\ ripciót és a transzlációt elindító szabályozó szakaszhoz képest megfelelően kell elhelyezkedniük. Bizonyították, hogy egy adott operonban közönséges körülmények között nem szereplő géneket beépíthetünk az operonba, a beépült gén az operon szabályozás alá fog kerülni. A klasszikus bizonyítékot Jacob és munkatársai írták le (J. Moh Bioi., 13, 704, 1965). Ebben a kísérletben a purin bioszintézisben résztvevő enzimeket meghatározó géneket a laktóz operon által szabályozott szakaszba építették be. A purin bioszintézis enzimjeinek kifejeződését laktóz vagy laktóz-analóg hiányában ezután represszálni tudták, az enzimek kifejeződése függetlenné vált az addig őket szabályozó környezed tényezőktől. A gének transzkripcióját szabályozó operátor szakaszon kívül ismeretesek stop jelet reprezentáló kodonok, ezek egy adott protein C-terminális végét jelzik. Erre vonatkozóan lásd a 2. táblázatot. Ezeket a kodonokat terminációs szignálként vagy nonszensz ködönként ismerjük, mivel általában nem határoznak meg aminosavakat. Egy operon :>n belüli strukíúrgénck terminációs szignáljának k ésesé fuzionált gént hoz létre, ilyenkor két szomszédos gén által meghatározott két különböző aminosav-szekvenciából álló úgynevezett kimer fehérje szintézise következik be, a két különböző protein peptidkötcssel van összekötve. Gének fúziójakor szintetizálódó kimer proteint ír le Benzer cs Champc, (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 43, 114, 1962). Amikor egy adott gént izoláltunk, tisztítottunk cs beépítettünk egy transzfer vektorba, azaz létrehoztuk a gén klónozását, el kell érnünk jelentős mennyiségben való előállítását. A klónozott gént megfelelő mikroorganizmusba transzferáljuk, ahol 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
