196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196 237 2 a gen a mikroorganizmus szaporodásakor repiikálódik és amely mikroorganizmusból ezután ismert módszerekkel újra izolálható. Ily módon további kísérletekre, módosításra és más vektorokba vagy ugyanazon vektorokon belül más lokuszokha való beépítéshez folyamatosan rendelkezésünkre áll a gén. A gén kifejezésére a klónozott gént megfelelő orientációban és leolvasási fázisban oly módon építjük be egy szabályozó szakaszba, hogy az a prokarióta gén leolvasása során olyan kimer protein szintézisét eredményezze, amely tartalmazza a klónozott génben kódolt aminosav-sorrendet. A kimer protein megfelelő helyen való hasítására, azaz az aminosav-sorrend felszabadítására különböző specifikus protein hasítási technikát használhatunk, a hasított fehérjét ezután ismert módszerekkel tisztítjuk. A szabályozó szakaszhoz képest megfelelő helyzetben lévő kiónozott gént tartalmazó és kifejeződő transzfer vektor előállítására vonatkozóan lásd. Polisky és munkatársai (Proc. Nac. Acad. Sei, USA, 73, 3900, 1976), Itakura és munkatársai (Science, 198, 1056, 1977), továbbá Villa—Komaroff és munkatársai (Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 75, 3727,1978), Mercercau—Puijalon és munkatársai (Nature, 275, 505, 1978), és Chang és munkatársa (Nature, 275, 617, 1978) közleményeit és a 933035 számú, Ruttcr és munkatársai által leírt egyesült államokbeli leírást. A fenti irodalomban ismertetettek a jelen leírás részét képezik. A Science 198 1056 (1977) cikke szerint a 14 aminosavból álló szomatosztatin génjét szintetizálták, ésagéntpBR322 plazmidon É.coli ß-galaktozidáz génjével fuzionálták. Az E. colinak a kimer plazmid DNS-sel végzett transzformálásával olyan polipeptid szintetizálódott, mely magában foglalta a szomatosztatinnak megfelelő peptidet is. A gént úgy alakították ki, hogy az N-terminá!is végen Met fejeződjön ki, később specifikus hasítás miatt. A 868853 sz. belga szabadalmi leírás baktériumokban kifejeződésre alkalmas mRNS tisztítását ismerteti. Klónozást végeztek humán korion szomatomammatropin (pHCS— 1) és humán növekedési hormon esetén (pHGH—1)? a klónozást pMB—9 és Eco Rí, illetve pBR322 és HindlII alkalmazásával végezve. A cikk nem tesz említést növekedési előhormonról. A Nucleic Acid Research 6 915 (1978) cikke patkány prolaktin gént tartalmazó rckombináns DNS előállítását és analízisét ismerteti. A klónozást pBR322-vel (PstI) végzik, de kifejezésről nem tesznek említést. Az előállítás során kis valószínűséggel keletkeznek ugyan növekedési hormont termelő transzformánsok, növekedési előhormon termelésről azonban nincs ismertetés. A 867424 sz. belga szabadalmi leírás patkány preproinzulin és részben patkány növekedési előhormon és humán növekedési hormon gén tisztítására, klónozására és jellemzésére vonatkozik, kifejeződést azonban nem végeznek. Egy emlős fehérjét, például a humán pre-növekedési hormont, ha rekombináns dezoxjribonukleinsav technikával kívánunk előállítani, úgy először az emlős gén izolálására oly módon, hogy a kiónozott gént hibridizációs próbaként használjuk fel. Ezen felül felhasználhatjuk a klónozott gént hibridizációval azonos vagy rokon gének függetlenül izolátumainak azonosítására vagy homológiájuk megállapítására. A genetikai kód természetéből adódóan klónozott gén megfelelő leolvasási fázisban transzlatálva (átfordítva) kizárólag annak az adott aminosav-sorrendű fehérjének a termelését fogja irányítani, amelynek a genetikai kódja ennem megfelel és sohasem másét. A humán pre-növekedési hormont meghatározó kiónozott gént többféle úton használhatjuk fel. Ha kifejeződő transzfer vektorba építjük be, úgy a clónozott gént hordozó vektorral transzformált gazda mikroorganizmus a humán pre-növekedési hormont fogja szintetizálni. A transzformált gazdasejt növekedésekor növekedési előhormon szintézise kimer protein alakjában történik meg. Ha a kimer protein prokarióta szakasza egy kiválasztott vagy más módon megvalósuló gazdasejt fehérjének úgynevezett szignál szakasza, úgy a kiválasztás vagy a más módon való megvalósulás bekövetkezik, a növekedési előhormont tartalmazó kimer fehérje tisztíthatósága és stabilitása pedig nagymértékben növekszik. Abban az esetben, ha a prokarióta rész rövid, úgy a prokarióta sejtből való kiválasztást maga az előszekvencia segítheti elő, abban az esetben, ha ez az előszekvencia a prokarióta sejtben az curkarióta sejtben meglévő funkcióhoz hasonló szerepet tölt be. A klónozott gént felhasználhatjuk továbbá részleges homológ szekvenciákat tartalmazó genetikai anyag izolálására, hibridizációs módszerekkel. Ily módon izolálhatok más emlős fajok növekedési hormonjainak génjei, mivel élettani szempontból vizsgált hasonlóságuk hiánya ellenére a hatásos hibridizációhoz elegendő mennyiségű hasonló szekvenciák szerepelnek bennük. A különböző állatfajok növekedési hormonjai mezőgazdasági és állatorvosi célokra használhatók. Egyetlen ember növekedési hormonját meghatározó gén hibridizációs technikával izolálható abból a célból, hogy analizálhassuk, és kezelhessük az adott specifikus növekedési zavart. A klónozott és a humán növekedési előhormont meghatározó gént különböző módszerekkel felhasználjuk a növekedési előhormon előállítására. A növekedési előhormon használható, mivel ismert enzimatikus és kémiai módszerekkel növekedési hormonná alakítható. Például oldható enzimkészítménnyel lehasíthatjuk az előszekveniát, ahogy azt Blobel és munkatársai (lásd fent) leírják a szignálpepticlek specifikus eltávolítása kapcsán. A találmány szerinti eljárás értelmében klónozunk egy humán növekedési előhormont meghatározó bázis-szekvenciát tartalmazó cDNS molekulát. A klónozott cDNS szerkezetét nukleotid-szekvencia analízissel bizonyítjuk. A genetikai anyag eredeti forrása az emberi agyalapi mirigy daganatos szövete, amelyet műtéti úton kapunk. A genetikai anyagot előnyösen egyetlen ember sejtjeiből izoláljuk és az emberi tumorból származó gén klónozására speciális technikát használunk. A sejtekből hírvivő ribonukleinsavat izolálunk és kromatográfiával és üiepítéssel részlegesen tisztítjuk. Az aktív frakciókat oly módon azonosítjuk, hogy vizsgáljuk sejtmentes fehérjeszintézist végző rendszerijén a frakciók körülbelül 200 aminosav-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
