196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 betűk a dezoxi-nukleotid szekvenciát alkotó purin vagy timidin bázisok helyett állnak. Ezek az alábbiak: A=adenin G=guanin C=citozin T=timin X=T vagy C, ha Y=A vagy G X=C, ha Y=C vagy T Y=A vagy G, ha X=T W=C vagy A, ha Z=A vagy G W=C, vagy Z=C vagvT Z=A, G, C vagy T, há W=C Z=A vagy G, ha W=A QR=TC, ha S=A, G, C vagy T QR=AG, ha S=T vagv C S=A, G, C vagy T, ha QR=TC S=T vagy C, ha QR=AG J=A vagy G K=T vagy C L=A, T, C vagy G M=A, C vagy T A jelen leírásban ismertetett célok szempontjából fontos tulajdonsága a kódnak az, hogy mindegyik aminosavat egyetlen trinukleotid darab, nukleotid triplctnek is nevezett szakasz határoz ineg. A szomszédos tripletcket összekapcsoló foszfo-diészler-kötés kémiailag megkülönböztethetetlen az összes többi dezoxiribonukleinsavban szereplő internukleotid kötéstől. Ily módon a nukleotid-szekvenciát a leolvasási sémát meghatározó további információk nélkük nem lehet egyetlen aminosav-szekvenciára vonatkoztatni. A leolvasási sémán értjük a sejt által felismert tripletek azok csoportját, amely a dekódolás során a genetikai üzenetet képviseli. A legtöbb rekombináns dezoxiribonukleinsav technika kétféle vegyületet használ fel, transzfer vektorokat és restrikciós enzimeket. Ezeket az alábbiakban ismertetjük. Transzfer vektornak nevezzük azt a dezoxiribonukleinsav molekulát, amely egy gazdasejtbe, mikroorganizmus törzsbe juttatva saját replikációját is biztosító genetikai információt tartalmaz. A bakteriális genetikában általánosan használt transzfer vektor például a különböző plazmidok és bizonyos baktérium fágok dezoxiribonuklein-sava. Bár a jelen szabadalmi leírás szerint plazmidokat használunk transzfer vektorként, érthető módon más transzfer vektorokat is használhatunk. Plazmádnak nevezzük azt az autonóm replikáció dezoxiribonukleinsav molekulát, amely mikroorganizmus sejtekben található és amely különbözik a gazdasejt gcnomjálól. A plazmád genetikailag kapcsolódik a gazdasejt kromoszómájához. A plazmád dezoxiribonukleinsav általában kettős szálú gyűrűs szerkezetű, molekulasúlya néhány millió dalion, bár egyesek molekulasúlya nagyobb, mint 10s dalton. Általában a sejt teljes dezoxiribonukleinsav tartalmának csak kis részét képviselik. A transzfer vektor dezoxiribonukleinsav a gazdasejt dezoxiribonuklcinsavától a kettő közötti nagyságban mutatkozó különbség alapján különíthető cl. A transzfer vektorok gazdasejten belüli rcplikációjukat biztosító genetikai információt hordoznak, ez a replikáció a legtöbb 4 e setben független a gazdasejt osztódásától. Egyes plazmidok rcplikációjának mértéke a kísérletező által biztosított növekedési körülményekkel befolyásolható. A plazmid dezoxiribonukleinsav zárt gyűrűként létezik. Megfelelő módszerekkel felnyithatjuk a gyűrűt, más forrásból származó dezoxiribonuklcinsaval építhetünk be, majd a gyűrű bezárása után a beépített dezoxiribonukleinsavat tartalmazó megnagyobbodott molekulát kapunk. A baktérium fágok dczoxiribonukleinsavak más forrásból származó dezoxiribonukleinsav szegmenseket tartalmazhat, bizonyos nem létfontosságú fág gének helyett. A transzfer vektor tehát külső forrásból származó dezoxiribonukleinsav darabot hordoz. Az átvitelt transzformációnak ismert eljárással végezzük. A transzformáció során a baktérium sejteket a plazmid dezoxiribonukleinsavval keverjük, amikor a teljes plazmid molekula belép a sejtekbe. Bár a belépés mechanizmusa nem ismert, lehetséges a lehető legmagasabbra emelni azon baktériumsejtek számát, amelyek képesek a plazmid dezoxiribonukleinsavat felvenni, így transzformálódni. Ezeket a módszereket kísérleti úton határozzuk meg. Amikor egy sejt beépítette a plazmidot, ez utóbbi rcplikálódik a sejten belül és az utód molekulák osztódáskor eloszlanak a leánysejtek között. A plazmid dezoxiribonukleinsavában lévő nukleotid-szekvencia által meghatározott bármely genetikai információ a gazdasejt számára kifejezhető. Például a transzformált gazdasejt a plazmidon kódolt tulajdonságokat, például bizonyos antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát felismer. A különböző plazmidokat felismerhetjük a különböző tulajdonságok vagy tulajdonságok kombinációja révén, amelyek a plazmidot tartalmazó gazdasejtben megnyilvánulnak. Bármely adott plazmidot nagy mennyiségben előállíthatunk oly módon, hogy a plazmidot tartalmazó tiszta tenyészetet növesztjük, majd a sejtekből izoláljuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat. A restrikciós endonukleázok hidrolitikus enzimek, a dezoxiribonukleinsav molekulák specifikus helyein hasítanak. A restrikciós endonukieáz által hasított helyet specifikus nukleotid-szekvenciák határozzák meg. Ezt a szekvenciát a restrikciós endonukieáz által felismerhető helynek nevezzük. Különböző forrásokból izoláltak restrikciós endonukieázokat, ezeket az általuk felismerhető dezoxiribonuklcinsav szakasz nukleotid-szekvenciája szerint jellemezték. Egyes restrikciós endonukleáz.ok mindkét szál azonos pontján hasítják a fosztodiészter-kötést, amikor úgynevezett „blunt" végek jönnek létre. Mások egymástól néhány nukleotiddal elválasztott kötések hidrolízisét katalizálják, ily módon szabad egyszálú végek jönnek létre a hasított molekula mindkét végén. Ezek az egyszálú végek önmagukra nézve kiegészítőek, mert kohézívek, ily módon felhasználhatók a hidrolizált dezoxiribonukleinsav molekula új kötésére. Mivel egy adott enzim hasítására érzékeny dezoxiribonukleinsav molekula ugyanazt az enzim által felismerhető helyet kell, hogy tartalmazza, a hidrolízis során ugyanazok a kohézív végek jönnek létre, ily módon lehetségessé válik különböző dezoxiribonukleinsav molekulák összekapcsolása, ha ugyanazon restrikciós endonukleázzal kezeltük őket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 65
