196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196 236 2 pBR322-ben a tetraciklin rezisztenciát és az ampicillin rezisztenciát kódoló gének között van, így az ampicillin és tetraciklin rezisztencia génjei nem inaktiválódnak a hibrid DNS beépítésének hatására ezen a helyen. A találmány szerint előállított mikroorganizmusok a Culture of Collection of the Microbiological Research Establishment Porton Down-i deponáló helyen helyeztük letétbe 1978. december 15-én pBR322 HBV-A-tól F-ig terjedő számon. Ezeket a tenyészeteket az alábbiakban jellemezzük: A: E. coli HB 101/pBR322-ftí I dG: HB V-kPN I De: TetR Amps HBV+ VA+ B: E. coli HB 101/pBR322-ftï I dG: HBV-Őnm HI dC: Tet« Amps HBV+ VA+ C: E. coli HB 101/pBR322-Psí I dG; HVB-Sg/II dC: Tét« Amps HBV+ D: E. coli HB 101/pBR322-Pst I dG: HBV-£co RÍ dC: Tét« Amps HBV1 E: E. coli HB 101/pBR322-Awn HI: HBV-/?«m- HI: Tets AmpR HBV1 F: E. coli HB 101/pBR322-£co RI: HBV-£ra Rí: Tet« Amp« HBV* A tenyészetek egy részét 1979 dec. 19-én a skóciai Aberdeenben is deponáltuk a National Collection of Industrial Bacteria gyűjteményben. A kultúrák fent említett nómenklatúrája a kultúra alábbi leírását tartalmazza: gazda/klónképző hordozó; a restrikciós hely a klónképző hordozóban az adott esetben meghosszabbított nukleotid feltüntetésével; hepatitisz B vírus restrikciós hely a hepatitisz B vírusban az adott esetben jelenlévő meghosszabbítás jelzésével: tetraciklinnel (Tet) és ampicillinnel (Amp) szemben mutatott rezisztencia (R) vagy érzékenység (S), pozitív hibridizáció HBV DNS-sel a telep hibridizációs tesztben (I. fent (HBV1) és HBV antigenicitást mutató polipeptid előállítása (1. fent) (VAf). A fenti nómenklatúra alapján a pBR322-BV-A olyan E. coli MB 101 kultúrát jelöl, amely plazmidként olyan rekombináns DNS-t tartalmaz, amely Pst I. helyen hasított és 3' végen polidG véggel meghosszabbított pBR 322-ből és az ehhez kapcsolt Kpn I-gyel hasított és a 3' végén poli dC-vel meghosszabbított HBV DNS-ből áll és ez a kultúra a tetraciklin iránt rezisztens, az ampicillinre érzékeny, a HBV DNS hibridizációs tesztben pozitív és HBV antigenicitást mutató polipeptidet termel. Természetesen a hibrid mikroorganizmusok, a rekombináns DNS molekulák és a polipeptidek nincsenek a fent felsorolt előnyös foganatosílási módra korlátozva. A hibrid organizmusok a rekombináns DNS molekulák és a polipeptidek az előállítás alatt vagy utólag ismert módon módosíthatók. így pl. hatékonyabb kifejeződést szabályzó szekvenciák alkalmazhatók a HBV gének vagy hibrid gének transzkripciójára mutációkat is vezethetünk be, hogy a nem-kívánatos géntermékek szintézisét csökkentsük, a gazdasejtekben csökkenthetjük a proteáz szintet, a HBV géneket tartalmazó, hővel-indukálható lizogéneket építhetünk be a gazdasejt kromoszómájába vagy más módosítások és eljárások alkalmazhatók a sejtekben lévő génmásolatok számának növelésére vagy a kívánt polipeptideket termelő sejtek termelékenységének fokozására. Azonkívül, hogy HBV antigenicitást mutató polipeptidek előállítására alkalmazhatók, a találmány szerinti hibrid mikroorganizmusok az egész hepatitisz B vírus genomot vagy egy részét tartalmazó nagy mennyiségű DNS előállítására is alkalmasak. így pl. klóramfenikoinak a táptalajhoz való adagolása, megfelelő sejt sűrűség elérésekor vagy mutációk használata a HBV szekvenciákat tartalmazó bakteriofág hibridek lízisének megakadályozására eddig el nem érhető HBV DNS mennyiségek előállítását teszi lehetővé. Az ily módon előállított HBV DNS-t arra használhatjuk, hogy meghatározzuk a genom nukleotid szekvenciáját és ebből a HBV antigének aminosav szekvenciáját és génjét, valamint magukat a struktúr géneket. Ezeknek a szekvenciáknak az ismerete segít mege '"-ni a hepatitisz B vírus biológiáját és a fenti módosítások lehető legjobb kihasználását teszi lehetővé.- DNS fragment térképezés és nukleotid szekvencia meghatározás 1. Hepatitisz B belső antigén A találmány szerinti eljárással kapott rekombináns DNS molekulákat, amelyek átadták a gazdasejteknek a HBcAg szintétizáló képességüket — ahogy a szilárd fázisú radioimmunoteszttel kimutattuk — választottuk ki a szekvencia analízis céljára. A rekombináns DNS molekulákból a megfelelő restrikciós enzimekkel történő emésztéssel állítottuk elő a fraginenteket és a fvagmenteket az 5' végükön [a—-^P] ATP-vel és T4 polinukleotid kinázzal megjelöltük. Az egyes fragmentek nukleotid szekvenciáit az ismert kémiai lebontási módszerekkel határoztuk meg. [A. M. Maxam és W. Gilbert. „A New Method For Sequencing DNA”, Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 74 , 560 — 564. o. 11977]]. A kapott nukleotid szekvenciákat a 3—9. ábrán ábrázoltuk. A szekvenciát a belső gén ATG transzlációs iniciációs kódonjának A-jától kezdve kezdjük számozni. A HBCAggénjének nukleotid szekvenciáját és az ebből a génből levezetett polipeptid aminosav szekvenciáját (első leolvasó keret) az 1—549. nukleotidok között ábrázoltuk a 3—9. ábrán. Az ezzel a génnel kódolt polipeptid mérete közel van a 19000 molekulasúlyhoz, (a Dane-részecskékből származó belső antigénekre megfigyelve). A jelen szerkezeti meghatározás azonban nem zárja ki annak a lehetőségét, hogy az autentikus antigén in vivő képződése közben néhány aminosav kihasadjon a polipeptid amino végéből. Ez a szerkezet továbbá nem vesz figyelembe olyan más vagy további módosításokat, amelyeket a polipeptidnek más humán enzimekkel, pl. proteineket glükoziláló enzimekkel való kölcsönhatása okoz. Ezért kár az itt meghatározott polipeptid szerkezet nem feltétlenül azonos az in vivo talált HBcAg-vel, de igen hasonló, ha nem azonos immun választ ad. Valamennyi megvizsgált rekombináns DNS molekulába úgy épült be a HBV DNS, hogy a belső antigén gén ugyanolyan transzlációs fázisban ma-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
