196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 radt, mint a pBR322 penicillin rezisztencia génje. Ezen felül a különböző rekombinánsokban a HBV DNS beépülés az azonos helyzetű egy vagy két nukleotidján beliii kezdődött a HBV szekvenciában. Minthogy ezek a rekombináns DNS molekulák különböző restrikciós enzimekkel pl. Bam Hívei és Kpn 1-gyel emésztett HBV DNS-bő! származnak, ez az egyedi kapcsolódás meglepő és oka egy, a HBV-DNS-sel toldott polinukleotid véletlenszerű szakadása lehet a Dane-részecske endogén DNS-ének a bemetszésénél. (1. ábra). A különböző transzlációs fázisban beépült HBV DNS-t tartalmazó rekombináns DNS molekulák nem fejezték ki a HBcAg gént és az ilyen rekombináns DNS molekulákkal transzformált gazdasejtekben nem mutattunk ki HBV antigenicitású polipeptidet. Természetesen érthető, hogy az ilyen gént ki nem fejező gazdasejtek és rekombináns molekulák azért még hasznosak a találmány szerinti HBV DNS előállítási eljárásban. Bár várható lett volna, hogy a HBV DNS beépülések kifejeződése útján kapott HBcAg vagy fragmentjei a peniciilináz rezisztencia génjének P-laktamáz termékével fognak egyesülni kis számú glicin csoporton keresztül, nem ez volt a helyzet. Ehelyett a ß-laktamäz minden esetben 5—8 glicinen keresztül egyesült egy azonos peptid szekvenciával, de ez a szekvencia 25 amínosav után befejeződött. Ebben a leolvasó keretben (1. keret, 3. ábra) a stop kodont (TAG) három nukleotid, majd egy iniciációs kodon követi, melyből a transzláció akadálytalanul folytatódik és így egy hoszszóban 183 aminosavat tartalmazó polipeptidet kapunk. (3—8 ábra). Így a belső antigén aktivitást jellemző rész kb. 21000 dalton molekulasúlyú polipeptidból áll, amely de novo a HBV szekvenciából van lefordítva a rekombináns DNS molekulából átírt mRNS-en belül. Ez a polipepíid molekula a gazdasejten belül marad, mert nem kapcsolódik a kiválasztott peniciilináz hordozó proteinhez a beillesztett HBV DNS stop és start kodonjainak átrendeződése miatt. 2. Hepatitist B felületi antigén A HBsAg génjének nukleotid szekvenciáját és az ebből a génből levezetett polipeptid aminosav szekvenciáját (3. olvasó keret) is a 6—8. ábrán ábrázoljuk az 1437—2114. nukleotidok között. Ennek a polipeptidnek az aminosav szekvenciája az N-végződésen kezdődik a Met-Glu-Asn-lIe- Thr-Ser szekvenciával. Ezt a kezdeti aminosav szekvenciát D. L. Peterson és társai határozták meg autentikus humán HBsAg-ből: „Partial Amino Acid Sequence Of Two Major Component Polypeptides of Hepatitis B Surface Antigen”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1530—1534 o. [1977]. A protein aminosav szekvenciája a 6—8. ábrán folytatódik egy stop kodonig, amely 226 aminosavval van odább. Ez a 226 polipeptid szekvencia 25400 delton molekulasúlyú proteinnek felel meg. A HBsAg aminosav szekvenciáját és hosszát függetlenül igazoltuk megfelelő rekombináns DNS molekulák szekvencia analízisével: P. Valenzuela és tsai, „Nucleotid Sequence of The Gene Coding10 For The Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen”, Nature, 280,815—819 o. [1979], A találmány szerinti rekombináns DNS moleku-1 Iákra meghatározott nukleotid szekvencia azt mutatja, hogy a HBcAg génjét kifejező DNS molekulák egyikének sincs olyan helyzetű HBsAg génje, melyről várható lett volna, hogy egy megfelelő gazdasejtben fejeződjön ki. Lényegében véve a HBcAg génjét kifejező plazmidokkal transzformáit sejt extraktumokban nem mutattuk ki HBsAg-t. Azonban, amint azt már fent említettük, ezeknek a géneknek a nukleotid szekvenciáját ismerve lehetővé válik a kifejeződési eljárás módosítása, fokozható a kitermelés és kedvezőbbé tehető a gének kifejeződése valamint eddig ki nem fejezett vagy ki nem mutatott polipeptidek termelése. Javított rekombináns DNS molekulák előállítása HBVantigének előállítása céljából A fenti antigének génjei és aminosav szekvenciái hasznosak az antigén vagy gén/baktériumsejt termelési szintjét növelő módszerek tervezésében. Egy protein termelési szintjét két lényeges tényező befolyásolja: a sejten belüli gének másolatainak száma és a génmásolatok átírásának és; lefordításának hatékonysága. A transzkripció és a; transzláció (a kettő adja a kifejeződést) hatékonysága viszont rendszerint a kívánt kódoló szekvencia előtt elhelyezkedő nukleotid szekvenciáktól függ. Ezek a nukleotid szekvenciák vagy kifejeződést szabályozó szekvenciák határozzák meg többek között azt a helyet, ahol az RNS polimeráz kölcsönhatásba lép a transzkripció megindítására (promoter szekvencia) és ahol a riboszómák kötődnek és kölcsönhatásba lépnek az mRNS-sel (a transzkripció terméke) a transzláció megkezdésé-, re. Nem minden ilyen kifejeződést szabályzó szekvencia működik egyformán hatékonyan. Ezért előnyös a kívánt proteint kódoló speciális szekvenciák elválasztása a szomszédos nukleotid szekvenciáktól és ehelyett ismert kifejeződést szabályozó szekvenciákhoz kapcsolása a nagyobb kifejeződési szint elérésére. Ennek elérése után, az újonnan elrendezett DNS fragmentumot egy sokszorosítást elősegítő (multikópia) plazmidba vagy bakteriofág származékba építjük, hogy a sejten belül a gén másolatok számát fokozzuk és tovább javítsuk a kifejezni kívánt protein termelését. Illusztrációs célokból a HBcAb génre meghatározott szekvenciát ily módon alkalmaztunk a HBcAg termelésének javítására E. coliban. Egy ilyen folyamatot ábrázol a 10. ábra. A HBcAg DNS szekvenciájának vizsgálata a 3. ábrán azt mutatja, hogy ezt a gént megelőzi a 26. nukleotid-nál (AGCT) egy Alu I célpont és a 22. és 1950. nukleotidoknál Eco Rí* célpontokat és 209- nél Eco RII célpontokat (CCTGG), 280-nál Hae III célpontot és 246 és 461. nukleotidnál (GGACC GGTCC) Ava II célpontokat tartalmaz. A fenti komplex helyzet miatt egyszerű, ha a belső antigént kódoló szekvenciát két lépésben hatékonyabb kifejeződést szabályozó szekvenciákra visszük át. így pl. ha egy, a találmány szerinti eljárással kapott, a 3. ábra szerinti -80 és 2270-es számú 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
