196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
196236 2 Az egyik ELISA teszt során egy mikrotizáló lemezt HBcAG-vel vonunk be és ehhez adjuk a páciens szérum mintáját. Egy inkubációs periódus után, amelynek folyamán bármelyik antitest kölcsönhatásba léphet az antigénnel, a lemezt mossuk, és egy iaboratóriumi állatban képezett és egy jelzett enzimmel összekapcsolt antihumán antitestekből álló készítményt adunk hozzá, újabb inkubáció következik, amikor a reakció lejátszódik, majd a lemezt ismét mossuk. Ezután enzim szubsztrátot adunk a mikrotiter lemezhez és addig inkubáljuk, amíg az enzim a szubsztrátra hat és a végső készítmény abszorpcióját mérjük. Az adszorpcióban beállt nagy változás pozitív eredményből tanúskodik. — Rekombináns DNS molekulákból nyert polipeplidek in vivo hutása A találmány szerinti E. coli rekombináns DNS molekulából lefordított antigén polipeptidek biológiai aktivitását úgy mértük, hogy HBcAg-t kifejező steril baktérium sejtkivonatokat egyenlő térfogatú Freund-féle adjuvánssal történő összekeverés után nyulakba fecskendeztünk. Két állat nyers baktérium kivonatot és kettő pedig az extraktum Sephadex 650 oszlopon végzett írakdonálása után kapott mintát kapott. Az első injekció után két, majd öt héttel fagyasztott és tárolt, így teljes antigén aktivitását megőrzött azonos mintát adtunk injekció formájában az állatoknak. Az első injekció után több héttel időszakonként vércztettük az állatokat. O. Ouchterlony: „Immunodiffusion and Immunoelektrophoresis”. Handbook of Experimental Immunology (D. W. Weir cd.) (Black-well Scientific Publications, Oxford és Edinburgh) 19. fejezet (1976) irodalmi helyen referált módszer szerint immunodiffúziós kísérleteket végeztünk a nyúl szérumának (antitestek) összevetésére emberi hepatitisz B vírus belső antitesttel (HBcAb) emberi májból származó HBcAg-t használva [B. J. Cohen és Y. E. Cossart, „Application Of A Screening Test For Antibody To Hepatitis B Core Antigen”, h din. Path., 30. 709—713 o. [1977]). Mind a négy nyűi szérum adott precipitációs sávokat a HBcAg vei, amelyek azonosak az emberi forrásból származó HBcAg és a BcAb között kialakuló sávokkal. Ezért az E. coliban a találmány szerinti rekombináns DNS-sel szintetizált belső antigén in vivo szerologiailag aktív. Ez az aktivitás teszi lehetővé a mikrobiális sejtekben szintetizált vírus antigéneket hasznosító módszerek és készítmények alkalmazhatóságát az ember ellenanyagtermelésének fokozására. Ezeket a készítményeket és módszereket a találmány szerint előállított rekombináns DNS molekulákkal transzformált gazdasejtekben termelt polipeptidek jellemzik. A polipeptideket önmagukban vagy ismert gyógyá.szatiiag elfogadható hordozókkal, pl. fiziológiai sóoldaua! vagy más ismert segédanyagokkal együtt használhatjuk az ember vírusos fertőzésének kezelésére vagy megelőzésére. Mint már említettük, a Kpn HPst Ï kombinációtól eltérő restrikciós enzimeket is használhatunk a találmány szerinti rekombináns DNS molekulák előállítására. A pBR322 plazmidban és a HBV genom egy részében lévő egyéb felismerő helyeket a 2. és 3. ábra ábrázolja. A találmány szerinti eljárás ez utóbbi, kevésbé előnyös foganatosításii módját az alábbi példákkal szemléltetjük. BAM Hl, ECO RI, BGL II—PSTI kombinációk A Bam Hi Eco Ri és Bgl II alkalmazásával előállított HBV DNS fragmenteket nem lehetett könnyen közvetlenül összekapcsolni kohézió céljából a rövid 5' egyszálú nyúlványok jelenléte miatt. Ezért X exonukleázzal kezeltük a fragmenteket, a fenti nyúlványok eltávolítására, mielőtt a 3' végénél poli-dC szekvenciákat adtunk volna hozzájuk. Ezt úgy végeztük, hogy a restrikciós enzimmel kezelt DNS-t (korábban leírt oldat 10 pl-ét) 15 pl 100 mmólos nátrium-glicinátot, pH=9,5,10 mmólos magnézium-kloridot, és 100-os pl marha szérum albumint, 5 pl X exonukleázzal inkubáltuk 0°C-on 1,5 óráig. Az elegyet ezután fenollal és kloroformmal extraháltuk és a folyamatot folytattuk. Abban a készítményben, amelyben Báni Hl-t használtunk, a radioimmun-vizsgálat megerősítette, hogy HBV antigén fajlagosságú polipeptidet állítottunk elő. ! Közvetlen ligáció ECO RI—ECO Rí és BAM\ HI-BAM Hl Ahelyett, hogy a kohézió céljából megtoldanánk a DNS fragmenteket a gén fragmentek közvetlen ligációját használhatjuk a találmány szerinti eljárásokban. így pl. két további készítményban a HBV DNS-t (20 ng) restrikciós endonukieázzal kezeljük (Eco Rí vagy Bam Hl) 10 pl 10 mmólos trisz-HCl-t.J pH=7,5, 10 mmólos magnéziumkloridot, 10 mmólos 2-merkapto-etanolt, 50 mmólos 10 pl nátriumkloridot tartalmazó elegyben 37°C-on 1,5 óráig és elkeverjük azonos körülmények között azonos enzimekkel előzőleg inkubált pBR322 feleslegével. Egy koncentrált puffer-oldat 2 pl-ét (660 mmólos trisz-HCl, pH=7,5, 100 mmólos magnézium-kloríd, 10 mmólos EDTA, 100 mmólos 2-merkaptoetanol, 400 mmólos nátrium-klorid, 1 mmólos ATP) adjuk hozzá és az elegyet T4 DNS ligázzal (0,5 pl) lÓ°C-on 3 óráig, majd 0°C-on legalább 24 óráig inkubáljuk. Az oldatot 10 mmólos trisz-HCl-lel (pH=7,5) 0,1 ml-re hígítjuk és megfelelő E. coli HB 101 tenyészetek transzformálására használjuk a fent leírt módon. A Bam Hl enzimmel előállított rekombináns DNS molekulák esetében, a telepeket a hibridizációra történő szűrővizsgálat sereenelés előtt megvizsgáltuk inkább tetraciklinre mint ampiciilinre való érzékenységre, mert a Bam Hl célpontja a pBR322-ben a tetrad kiin rezisztenciát kódoló génen belül van és ezért egy sikeres beépítés ezen a felismerő helyen annak a rezisztenciának az elvesztését eredményezi, az ampicillin rezisztencia elvesztése helyett, mint a Pst I helyen történő beépülésnél történik. Az Eco Rí helyen előállított rekombináns DNS molekulák esetében a telepeket a hibridizációra való szűrővizsgálat előtt mind a tetracikiinnel mind az ampicillinnel szemben mutatott rezisztenciára megvizsgáltuk, mert az Eco Rí célpontja a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
